葉酸缺乏導致大鼠高同型半胱氨酸血癥與行為學改變.pdf

1、研究背景和目的:
　　 葉酸是人體必需的B族水溶性維生素，其不同的輔酶形式在一碳單位代謝過程中發(fā)揮重要作用，是嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶合成及同型半胱氨酸轉化為甲硫氨酸時再甲基化過程中不可或缺的物質。同型半胱氨酸是甲硫氨酸循環(huán)和半胱氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物，主要經(jīng)轉硫化、再甲基化過程代謝，需葉酸、維生素B12、維生素B6參與。葉酸是同型半胱氨酸代謝過程中重要的輔助因子，葉酸水平的升高可促進同型半胱氨酸再甲基化過程的進行。飲食中葉酸缺乏、

2、一碳單位代謝障礙等原因均可導致同型半胱氨酸循環(huán)受阻，不能正常代謝，引起同型半胱氨酸堆積，當空腹血漿同型半胱氨酸濃度＞15μmol/L則產(chǎn)生高同型半胱氨酸血癥。
　　 高同型半胱氨酸血癥與某些神經(jīng)精神疾病之間存在密切的聯(lián)系。有研究表明，高同型半胱氨酸可能具有神經(jīng)毒性，老年人同型半胱氨酸水平越高，大腦萎縮的可能性越大。在與相關疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，帕金森氏癥患者同時伴有高同型半胱氨酸血癥，在對抑郁癥患者的研究中也發(fā)現(xiàn)有一半的患者同型半胱

3、氨酸水平高于正常，且同型半胱氨酸水平較高的患者漢密爾頓抑郁等級評定的得分也較高。
　　 高同型半胱氨酸血癥損傷血管內皮細胞已被確立為心腦血管疾病獨立危險因素，國內外有關葉酸、同型半胱氨酸與抑郁癥發(fā)病相關性的流行病學調查報道較多，但結果不盡一致。有研究認為低葉酸與抑郁癥的發(fā)生具有相關性，葉酸缺乏是抑郁癥的危險因素，但也有報道稱同型半胱氨酸與抑郁癥相關，且同型半胱氨酸濃度每升高1μmol/L，發(fā)生抑郁癥的風險將增加2％-5％。

4、>　　 抑郁癥是危害人類健康的主要疾病之一，病因復雜，對其病因機制的探討是達到疾病預防及有效治療的必要途徑。目前對抑郁癥發(fā)病機制研究的熱點集中在神經(jīng)回路、單胺類神經(jīng)遞質、神經(jīng)內分泌與神經(jīng)免疫功能、遺傳因素與表觀遺傳學機制、神經(jīng)營養(yǎng)因子與神經(jīng)發(fā)生、細胞因子假說等，而葉酸缺乏、高同型半胱氨酸與抑郁癥發(fā)病的機制尚無定論，目前有幾種可能機制:同型半胱氨酸的神經(jīng)毒性作用、氧化應激損傷及葉酸抗氧化性及葉酸缺乏導致一碳單位代謝障礙影響神經(jīng)遞質合成等

5、機制相關。
　　 同型半胱氨酸的神經(jīng)毒性作用機制尚未完全明確，目前認為主要與N-甲基-D天冬氨酸受體過度激活和氧化應激相關。N-甲基-D天冬氨酸受體是與Ca2+通道偶聯(lián)的離子型興奮性氨基酸受體，可與谷氨酸樣受體激動劑-N-甲基-D天冬氨酸的特異性結合。海馬中存在大量谷氨酸能神經(jīng)元，同型半胱氨酸是內源性的谷氨酸能受體激動劑，它與N-甲基-D天冬氨酸受體有很高的親和力。同型半胱氨酸能激活促離子型和促代謝型谷氨酸受體，引起大量的鈣離子

6、內流致使鈣超載，損傷線粒體及激活蛋白酶核酸酶、磷酸酯酶、一氧化氮合成酶等，從而導致細胞代謝障礙結構及功能受損，導致神經(jīng)元功能失調，抑制神經(jīng)元的網(wǎng)絡活性。海馬中含有大量谷氨酸能神經(jīng)元，同型半胱氨酸過度激活N-甲基-D天冬氨酸受體，則易使海馬區(qū)神經(jīng)元受損。
　　 氧化應激是活性氧片段和抗氧化防御系統(tǒng)嚴重失衡所致的活性氧片段產(chǎn)物增多及抗氧化物質減少的病理生理過程，與神經(jīng)變性疾病并發(fā)癥的發(fā)生密切相關。研究表明氧化應激是同型半胱氨酸造成神

7、經(jīng)細胞損傷的重要的發(fā)病機制之一，同型半胱氨酸分子之間可以相互氧化，也可以同其它含自由巰基的氨基酸或蛋白質結合形成二硫化物復合物，產(chǎn)生過氧化氫和超氧陰離子，使氧化還原反應失衡，影響血管和神經(jīng)元的氧化還原反應信號轉導機制。超氧化物歧化酶是一種金屬蛋白酶，在體內是重要的內生性氧自由基清除劑，其活力高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。同型半胱氨酸能夠抑制超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化酶等抗氧化酶的活性，減少活性氧片段的清除，導致活性氧片段在細

8、胞內和線粒體內聚，啟動血液循環(huán)中的、細胞膜及線粒體膜上的脂質過氧化反應，使線粒體膜和細胞膜穩(wěn)定性下降，通透性增加，鈣穩(wěn)態(tài)調節(jié)失衡，導致細胞破壞。
　　 葉酸是一種有效的抗氧化劑，可清除氧過氧化氫和超氧陰離子等自由基團，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，抑制腦細胞過度凋亡和DNA大量破壞。葉酸缺乏可導致細胞內抗氧化防御系統(tǒng)失衡，增加氧化應激和細胞凋亡事件的發(fā)生，并可能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能并出現(xiàn)神經(jīng)病變、行為異常及認知功能障礙。實驗表明補充

9、葉酸可增強老年大鼠腦組織的抗氧化能力，使超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等抗氧化酶活性增高，谷胱甘肽含量上升，降低脂質過氧化物水平，減少氧化應激對神經(jīng)元的損傷。葉酸在一碳單位代謝過程中發(fā)揮重要作用，葉酸缺乏使一碳單位代謝受損，同型半胱氨酸水平升高，可能加重同型半胱氨酸的神經(jīng)毒性。
　　 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中重要成員之一，具有神經(jīng)保護作用，廣泛分布于哺乳動物腦組織中，對中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、穩(wěn)定性的維持發(fā)揮重要作用

10、。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子主要在神經(jīng)元內合成，順行性軸漿運輸至軸突末梢，釋放后通過特異性受體作用于靶組織發(fā)揮作用。此外，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子也可由神經(jīng)元的靶細胞分泌，反向營養(yǎng)神經(jīng)元，對神經(jīng)細胞的生長發(fā)育和保護修復起到十分重要的作用。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子由神經(jīng)元以功能依賴性的方式釋放，對神經(jīng)細胞的生長發(fā)育和保護修復起到重要作用，免疫組化證實，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子免疫陽性神經(jīng)元廣泛分布在大鼠腦內，以海馬齒狀回和皮層的含量為最高，已有研究

11、表明高同型半胱氨酸會降低大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量，從而導致大鼠記憶功能受損及行為學改變，但報道較少，機制尚不明確。
　　 人體自身不能合成葉酸，需經(jīng)飲食或藥物補充，葉酸缺乏又是導致高同型半胱氨酸血癥的常見原因，故本文旨在通過葉酸缺乏飼料建立大鼠高同型半胱氨酸血癥模型，觀察葉酸缺乏伴高同型半胱氨酸血癥引起大鼠行為學、海馬區(qū)神經(jīng)元病理學以及對大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及血清超氧化物歧化酶水平的影響，并通過研究高同型半胱氨酸

12、血癥大鼠神經(jīng)精神系統(tǒng)及行為學的改變，初步探討其可能機制，以期為抑郁癥的發(fā)生機制及防治思路提供啟示。
　　 方法：
　　 健康雄性SD大鼠28只，適應性喂養(yǎng)1周后分為2組:葉酸缺乏組18只，對照組10只。葉酸缺乏組喂食“葉酸含量為0mg/kg飼料”，對照組喂食葉酸含量為1.6mg/kg的普通飼料，飼養(yǎng)時間6周，建立葉酸缺乏、高同型半胱氨酸血癥大鼠模型。每周監(jiān)測大鼠體重變化，并觀察大鼠活動量、皮毛光潔度等一般狀態(tài)改變。實驗前

13、后測定血清葉酸、同型半胱氨酸、超氧化物歧化酶濃度，實驗6周后，曠場試驗監(jiān)測行為學改變，葉酸缺乏組、對照組分別取大鼠8只、5只，麻醉后開胸經(jīng)心腔用生理鹽水及4％多聚甲醛灌注后取腦，分離海馬，10％福爾馬林固定后石蠟切片，行HE染色觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元改變，余大鼠直接麻醉后處死冰上迅速取海馬組織并測定海馬區(qū)BDNF含量變化。統(tǒng)計學處理:應用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組計量資料組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗

14、，重復測量數(shù)據(jù)組間比較采用重復測量方差分析法，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　 結果：
　　 隨著飼養(yǎng)時間的延長，對照組大鼠皮毛光亮整潔，葉酸缺乏組大鼠色澤稍遜于對照組，且喜扎堆。2組大鼠體重均有增加，6周時與對照組比較，葉酸缺乏組大鼠體重顯著低于對照組，有顯著性差異（P＜0.05）。6周飼養(yǎng)后，行為學測試中曠場試驗水平運動及糞便粒數(shù)2項指標，葉酸缺乏組與對照組相比，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，垂直運動兩組無顯著性

15、差異（P=0.87）。
　　 實驗初始時2組大鼠血清葉酸、同型半管氨酸濃度無明顯差異，6周后葉酸缺乏組葉酸濃度顯著低于對照組（P＜0.01），葉酸缺乏組大鼠血清同型半胱氨酸濃度高于本組實驗開始時濃度(P＜0.01)。按照不同處理組分析，兩種飼料對大鼠血清同型半胱氨酸濃度的影響有顯著性差異(P＜0.01)。葉酸缺乏組超氧化物歧化酶呈增高趨勢，第0周與第6周(P＜0.01)、第4周與第6周(P＜0.01)、第4周與第6周(P＜0.0

16、1)比較，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗6周后葉酸缺乏組海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量低于對照組(P＜0.05)。
　　 海馬病理學顯示，對照組海馬CA1、CA3區(qū)的神經(jīng)元結構完整，排列整齊，形態(tài)正常，葉酸缺乏組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元排列較疏松，可見部分細胞缺失，出現(xiàn)空隙，部分胞體收縮呈圓形橢圓形，胞漿濃染，胞核固縮，上述表現(xiàn)在海馬CA3區(qū)尤為明顯。
　　 結論：
　　 1、葉酸缺乏飲食可導致大鼠出現(xiàn)類似抑

17、郁癥的行為學改變。
　　 2、通過葉酸缺乏飲食建立了大鼠高同型半胱氨酸血癥模型，大鼠血清葉酸濃度逐漸降低、同型半胱氨酸濃度的逐漸升高，最終出現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥，同時超氧化物歧化酶濃度升高。
　　 3、大鼠海馬組織發(fā)生病理學變化，表現(xiàn)為神經(jīng)元細胞缺失，部分胞體收縮呈圓形/橢圓形，胞漿濃染，胞核固縮，且在海馬CA3區(qū)尤為明顯，可能與葉酸缺乏所致高同型半胱氨酸血癥導致。
　　 4、大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量減低