Progranulin在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用.pdf

1、目的：
　　高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, hHcys)是導(dǎo)致終末期腎病(endstage renal disease，ESRD)的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因子和致病因素。近年來研究表明，hHcys能直接作用于腎小球，誘導(dǎo)腎小球功能紊亂，進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化，最終發(fā)展為終末期腎病。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和足細(xì)胞共同構(gòu)成了腎小球的濾過屏障，其中足細(xì)胞和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞對維持腎臟功能和濾過屏障的選擇通透性都具有十分

2、重要的作用。足細(xì)胞損傷可導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生，而腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂可介導(dǎo)炎癥應(yīng)答。但目前hHcys所致腎臟損傷特別是腎小球內(nèi)皮細(xì)胞與足細(xì)胞損傷的機(jī)制尚未完全明確。
　　顆粒蛋白前體（progranulin，PGRN）是一種自分泌生長因子，由7.5個(gè)重復(fù)的同源性富含半胱氨酸顆粒蛋白區(qū)域組成。在上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，與細(xì)胞增殖、腫瘤生長、胰島素抵抗、神經(jīng)退行性疾病、組織修復(fù)以及炎癥等多種病理生理學(xué)

3、進(jìn)程密切相關(guān)。前期我們課題組研究表明，在急性腎臟損傷中PGRN能夠通過抑制炎癥保護(hù)腎臟，但PGRN在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的慢性腎病中的作用，迄今未見報(bào)道。
　　研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腎臟損傷有著密切的聯(lián)系，參與足細(xì)胞功能紊亂和蛋白尿形成等過程。為此，本實(shí)驗(yàn)擬通過體內(nèi)和體外兩方面來研究PGRN在hHcys誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用及其調(diào)控機(jī)制與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。
　　方法與結(jié)果：

4、r>　　1.PGRN在高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的腎臟損傷中的表達(dá)
　　使用8周齡的C57BL/6J野生雄性小鼠隨機(jī)分為兩組，小鼠單腎摘除一周后，無葉酸飼料（folate free diet，F(xiàn)F diet）喂養(yǎng)10周構(gòu)建hHcys動(dòng)物模型，正常飼料(normal diet，norm diet)作為對照。高效液相色譜法（high performance liquidchromatography，HPLC）檢測無葉酸飲食血漿總同型半胱氨酸(

5、total homocysteine，tHcys)含量升高，證明hHcys模型構(gòu)建成功。酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)檢測尿白蛋白/肌酐比值升高;過碘酸-雪夫染色(periodic acid-schiff stain，PAS)方法對小鼠腎臟石蠟切片進(jìn)行染色和透射電鏡(transmission electron microscope，TEM)的方法觀察腎臟足細(xì)胞損傷，hHcy

6、s模型腎臟中出現(xiàn)系膜基質(zhì)增生，基底膜厚度不均，足突融合，提示腎臟功能障礙，腎小球出現(xiàn)損傷。ELISA檢測血漿中PGRN水平，發(fā)現(xiàn)血漿中PGRN降低。通過蛋白免疫印跡（western blot，WB）、免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry，IHC)、免疫熒光(immunofluorescence，IF)雙染驗(yàn)證PGRN在腎臟中表達(dá)變化和分布，在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞和近曲小管中均有表達(dá)，在腎小球中PGRN表達(dá)降低。體

7、外實(shí)驗(yàn)，使用L-型同型半胱氨酸(L-homocysteine，L-Hcys)刺激腎臟四種固有細(xì)胞腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(glomerular endothelial cell, GEnC)、腎小球足細(xì)胞（human podocyte，HPC）、系膜細(xì)胞(rat mesangial cell，RMC)及腎小管上皮細(xì)胞（human kidney2，HK-2），結(jié)果顯示PGRN在GEnC和HPC中呈現(xiàn)L-Hcys劑量依賴性降低。
　　2.PGR

8、N在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用
　　C57BL/6J野生雄性小鼠和Grn基因敲除小鼠(B6(Cg)-Gmtm1.1Aidi/J）雄性小鼠隨機(jī)分為四組，構(gòu)建hHcys動(dòng)物模型。檢測血漿tHcys，尿白蛋白/肌酐比值，并進(jìn)行PAS染色和透射電鏡分析，結(jié)果顯示，PGRN缺失不影響無葉酸飲食誘導(dǎo)的血漿Hcys水平的變化，但加重高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測腎臟中炎癥因子的表達(dá)、IHC檢測中性粒細(xì)胞

9、的標(biāo)記物L(fēng)y6B和巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物CD68，結(jié)果顯示PGRN的缺失加重hHcys導(dǎo)致的炎癥應(yīng)答及炎性細(xì)胞浸潤。WB、IF結(jié)果顯示，Grn基因敲除加重了hHcys介導(dǎo)的腎臟組織中足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白nephrin、podocin形態(tài)損傷，以及緊密連接蛋白o(hù)ccludin蛋白表達(dá)降低。體外實(shí)驗(yàn)，WB、IF結(jié)果顯示，外源重組PGRN(recombinant PGRN，rPGRN)能逆轉(zhuǎn)Hcys誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白閉合小環(huán)蛋白1（z

10、onula occludens-1，ZO-1）蛋白水平降低及形態(tài)的損傷。
　　3.PGRN在保護(hù)高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的腎臟損傷中的作用機(jī)制
　　高同型半胱氨酸血癥野生型及Grn基因敲除小鼠腎臟中的β-catenin的明顯活化。體外實(shí)驗(yàn)中，L-Hcys能夠誘導(dǎo)GEnC和HPC中β-catenin的活化，而加入外源rPGRN則能抑制這一作用，說明PGRN可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來保護(hù)hHcy誘導(dǎo)的腎臟損傷

11、。
　　結(jié)論與創(chuàng)新性：
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)，PGRN在hHcys模型腎臟中顯著降低，并且在GEnC和HPC中，PGRN呈現(xiàn)出Hcys劑量依賴性降低。PGRN缺失加重hHcys介導(dǎo)的腎小球損傷、炎癥應(yīng)答、炎癥細(xì)胞浸潤、裂孔隔膜蛋白和緊密連接蛋白破壞，從而損傷腎小球?yàn)V過屏障及腎臟功能。
　　PGRN的保護(hù)作用可能依賴于對Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制。本研究有助于進(jìn)一步闡明高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)腎損傷的病理生理學(xué)