HMGB1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的初步功能研究.pdf

1、研究背景和目的:原發(fā)性肝細胞癌（HCC;簡稱肝癌），在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率排在第六位，每年全世界的發(fā)病是62.6萬，我國每年死于肝癌約11萬人，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45％。相對于高死亡率，早期肝癌的發(fā)現(xiàn)比例卻非常低。近年來，雖然針對肝癌的治療手段不斷更新（包括手術(shù)切除、肝移植術(shù)、放射治療、介入治療、微創(chuàng)消融治療等），但肝癌治療的總體療效并無明顯提高，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是影響肝癌預(yù)后的最主要因素。因此，加強對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機制的研究，挖掘有

2、意義的肝癌轉(zhuǎn)移分子標志物，尋找新的防治靶點，是目前肝癌研究熱點之一。
　　 HMGB1屬于HMG（HMG）的亞家族成員，于20世紀70年代在小牛胸腺中發(fā)現(xiàn)，是一種含量豐富的核蛋白，分子質(zhì)量約30kD，存在于所有真核生物中。人的HMGB1基因定位于染色體13q12，包含5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼含215個氨基酸的蛋白。HMGB1高度保守，人與嚙齒類動物氨基酸序列同源性高達99％以上，而小鼠與大鼠氨基酸序列完全一致。
　　

3、 HMGB1因其細胞定位不同而發(fā)揮不同的功能和生物學(xué)效應(yīng)。目前研究認為，除作為“晚期炎癥介質(zhì)”啟動炎癥反應(yīng)外，分泌到細胞外的HMGB1還可能與腫瘤的演進和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在增殖的細胞組織及分化活躍的細胞中，HMGB1基因表達有輕度的升高，而在乳腺癌、黑色素瘤、胃腸間質(zhì)細胞瘤、胰腺癌等腫瘤組織中，HMGB1的表達水平明顯高于其相對應(yīng)的正常組織，且與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。因此，認為HMGB1也參與了惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、演進

4、過程。Brezniceanu等在人原發(fā)性乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)了HMGB1蛋白的高水平表達，HMGB1可以阻斷Bcl-2家族促凋亡基因Bak誘導(dǎo)的細胞凋亡，其高水平表達可促進腫瘤的生長。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1過表達與鼻咽癌的TNM分期和臨床分期密切相關(guān)，表達水平越高的患者，總體生存率和無瘤生存率越低;抑制HMGB1表達，鼻咽癌細胞的侵襲性減小。Volp等[15]在結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)HMGB1及其受體RAGE共表達增強了結(jié)腸癌細胞的

5、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。應(yīng)用HMGB1反義寡核苷酸能顯著抑制結(jié)腸腫瘤細胞生長、遷移和侵襲，同時下調(diào)細胞信號通路上相關(guān)分子的表達[16]。在口腔鱗狀上皮細胞癌中，HMGB1可通過誘導(dǎo)其黑色素瘤抑制蛋白(MIA)的表達而有促進其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及新生淋巴管生成的作用[17]。上述研究表明，HMGB1是多種腫瘤的促癌基因和促進轉(zhuǎn)移基因。
　　 本研究擬應(yīng)用48例癌組織和癌旁組織組成的96點組織芯片，采用免疫組化方法檢測和觀察人體惡性腫瘤組織和正常組

6、織HMGB1表達情況;應(yīng)用Realtime-PCR、Wwstern blot和免疫細胞化學(xué)檢測7種人肝癌細胞株和1種人正常肝細胞株HMGB1基因/蛋白的表達;收集208例帶有5年完整隨訪資料的肝癌組織，應(yīng)用免疫組化檢測分析HMGB1蛋白在肝癌中的表達及其與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，同時結(jié)合臨床隨訪資料回顧性分析HMGB1蛋白表達與肝癌患者生存期的關(guān)系;利用基因沉默及過表達技術(shù)初步研究HMGB1基因在肝癌增殖、遷移及侵襲中的作用，探討HM

7、GB1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用;為肝癌患者的診斷、預(yù)后評價、綜合治療方案設(shè)計提供的理論依據(jù)。
　　 方法
　　 1、組織芯片技術(shù)分析HMGB1蛋白在人體正常組織和惡性腫瘤組織中的表達購買西安愛麗娜生物科技公司的組織芯片，由48例癌組織和48例癌旁組織組成的96點組織芯片，包括胃、淋巴結(jié)、結(jié)腸、直腸、肝、肺、腎、食管、乳腺、宮頸、卵巢、膀胱、皮膚、腦、前列腺、胰腺等16種器官的癌及對應(yīng)的癌旁正常組織。免疫組化方法檢測HMGB

8、1蛋白在人體正常組織和常見惡性腫瘤組織的分布和表達。
　　 2、HMGB1基因/蛋白在人正常肝細胞和肝癌細胞中的表達Realtime-PCR、Wwstern blot和免疫細胞化學(xué)等方法檢測HepG2，HCCLM6（簡稱M6），Huh7，MHCC97H（簡稱97H），MHCC97L（簡稱97L），HCCLM3（簡稱M3），BEL-7404等7種肝癌細胞株和人正常肝細胞株L02的HMGB1基因/蛋白的表達情況。
　　 3、

9、HMGB1蛋白在肝癌組織中的表達及臨床意義應(yīng)用免疫組化EnVisionTM二步法檢測HMGB1蛋白在208例肝癌組織中的表達;應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用x2檢驗分析HMGB1蛋白表達水平與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;采用Kaplan-Meier法回顧性分析HMGB1蛋白表達與肝癌患者生存期的關(guān)系;以COX回歸對各項指標單因素或多變量聯(lián)合與生存期的關(guān)系進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 4、HMGB1基因沉默對肝癌細胞生物學(xué)特

10、性的影響利用購買自上海吉瑪公司的含有HMGB1基因干擾片段的siRNA，采用瞬時轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染高表達HMGB1的97H肝癌細胞，用含空載體的病毒做對照。熒光定量PCR和Western blot檢測HMGB1干擾效率。利用cck-8檢測HMGB1基因沉默后對肝癌細胞體外增殖的影響;應(yīng)用未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室檢測HMGB1基因沉默后對肝癌細胞體外遷移能力的影響;應(yīng)用鋪基質(zhì)膠的Transwell小室檢測HMGB1基因沉默后對肝癌細胞體

11、外侵襲能力的影響。
　　 5、HMGB1基因過表達對肝癌細胞生物學(xué)特性的影響應(yīng)用購買自上海吉凱生物公司的含有HMGB1基因片段的GV142載體轉(zhuǎn)染低表達HMGB1基因的M3肝癌細胞，用含空載體的病毒做對照。熒光定量PCR和Western blot檢測HMGB1干擾效率。利用cck-8檢測HMGB1基因過表達后對肝癌細胞體外增殖的影響;應(yīng)用未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室檢測HMGB1基因過表達后對肝癌細胞遷移能力的影響;應(yīng)用鋪

12、基質(zhì)膠的Transwell小室檢測HMGB1基因過表達后對肝癌細胞侵襲能力的影響。
　　 結(jié)果
　　 1、組織芯片技術(shù)分析HMGB1蛋白在人體正常組織和惡性腫瘤組織中的表達惡性腫瘤組織中HMGB1陽性率達89.6％，正常組織陽性率77.1％，癌組織強陽性率54.1％，癌旁正常組織強陽性率6.5％。惡性腫瘤組織與癌旁正常組織HMGB1表達差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。癌組織中強表達例數(shù)占大多數(shù)，而正常組織多為弱至中

13、等強度表達。
　　 2、HMGB1基因/蛋白在肝癌細胞株和正常肝細胞株中的表達采用實時熒光定量PCR法檢測7種人肝癌細胞株和1種人正常肝細胞株中HMGB1基因的表達情況。在HMGB1在6種肝癌細胞:HepG2，M6，Huh7，97H，97L, BEL-7404表達水平均高于正常肝細胞中的表達水平，而肝癌細胞M3表達量低于正常肝細胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;Western blot檢測HMGB1蛋白與實時熒光定量PCR檢測的HMGB1

14、基因RNA表達趨勢基本一致;免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示，HMGB1蛋白在正常肝細胞株中陰性～弱表達，而在肝癌細胞株中均呈強陽性表達。
　　 3、HMGB1蛋白在肝癌組織中的表達及臨床意義免疫組化檢測結(jié)果顯示:HMGB1蛋白在208例肝癌組織中的高表達為134例(64.4％)，低表達為74例(35.6％)。HMGB1在肝癌的細胞核與細胞質(zhì)中都有表達，但在肝的正常組織呈陰性～低表達，在肝硬化組織呈低～中度表達;HMGB1蛋白表達水平除

15、了與AFP(P=0.03＜0.05)明顯相關(guān); HMGB1蛋白表達和各臨床病理參數(shù)與肝癌患者生存期的單因素分析，結(jié)果顯示HMGB1蛋白高表達、性別、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和血清AFP值是影響肝癌患者生存時間的因素(P值分別為:0.002、0.002、0.021、0.001、0.003、0.001);HMGB1蛋白表達、性別、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、血清AFP值與肝癌患者生存期的多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1蛋白表達、性別、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和血清A

16、FP值分別是影響肝癌生存預(yù)后的獨立因素(P值分別為:0.003、0.002、0.016、0.013、0.001)。
　　 4、HMGB1基因表達沉默對肝癌細胞生物學(xué)特性的影響①應(yīng)用含有HMGB1干擾片段的siRNA瞬時轉(zhuǎn)染外源性表達HMGB1較高的肝癌細胞M6。利用實時熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測各干擾片段HMGB1的表達情況，篩選干擾效率最高的片段為下一步實驗的研究對象（命名為M6/S2細胞）。
　　

17、 ②應(yīng)用cck-8檢測HMGB1基因表達沉默后細胞的體外增殖情況，與M6細胞和M6/Mock細胞相比，M6/S2細胞的增殖速度明顯減慢。綜合結(jié)果表明HMGB1基因沉默后，腫瘤細胞體外生長被抑制。
　　 ③應(yīng)用未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室檢測HMGB1基因表達沉默后細胞遷移能力的改變，結(jié)果顯示:與M6細胞和M6/Mock細胞相比，M6/S2細胞的遷移能力明顯降低(P＜0.05)，說明HMGB1基因的沉默抑制了肝癌細胞的遷移

18、能力。
　　 ④應(yīng)用鋪了基質(zhì)膠的Transwell小室檢測HMGB1基因表達沉默后細胞侵能力的改變，結(jié)果顯示:與M6細胞和M6/Mock細胞相比，M6/HMGB1-細胞的侵襲能力明顯降低(P＜0.05)，說明HMGB1基因的沉默抑制了肝癌細胞的侵襲能力。
　　 5、HMGB1基因表達增強對肝癌細胞生物學(xué)特性的影響①應(yīng)用含有HMGB1基因片段的GV142載體瞬時轉(zhuǎn)染外源性表達HMGB1較低的肝癌細胞M3，利用實時熒光定量P

19、CR和Western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染了HMGB1的M3細胞(命名為M3/HMGB1+)表達情況，轉(zhuǎn)染空載體GV142為對照實驗的研究對象（命名為M3/Mock細胞）。
　　 ②應(yīng)用cck-8檢測HMGB1基因過表達后細胞的體外增殖情況，與M3細胞和M3/Mock細胞相比，M3/HMGB1+細胞的增殖速度明顯增強。綜合分析HMGB1基因過表達后，能促進細胞的體外增殖。
　　 ③應(yīng)用未鋪基質(zhì)膠的Transwell小室檢

20、測HMGB1基因過表達后細胞遷移能力的改變，結(jié)果顯示:與M3細胞和M3/Mock細胞相比，M3/HMGB1+細胞的遷移能力明顯增強(P＜0.05)，說明HMGB1基因的過表達增強了肝癌細胞的遷移能力。
　　 ④應(yīng)用鋪了基質(zhì)膠的Transwell小室檢測HMGB1基因過表達后細胞侵襲能力的改變，結(jié)果顯示:與M3細胞和M3/Mock細胞相比，M3/HMGB1+細胞的侵襲能力明顯增強(P＜0.05)，說明HMGB1基因的過表達增強了肝

21、癌細胞的侵襲能力。
　　 結(jié)論
　　 1.HMGB1在多種惡性腫瘤組織強陽性表達，而在正常組織呈現(xiàn)弱至中等強度表達，我們認為其可能成為鑒別正常組織與癌組織的的生物學(xué)標志之一。
　　 2.HMGB1基因/蛋白在人肝癌細胞中的表達明顯強于正常人肝細胞，表明HMGB1可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的分子之一。
　　 3.HMGB1蛋白在208例肝癌標本中呈高表達，結(jié)合臨床隨訪資料分析表明HMGB1與患者的AFP值

22、密切相關(guān)，HMGB1蛋白高表達者的生存期明顯短于低表達者，提示HMGB1可作為肝癌預(yù)后判斷的重要指標;
　　 4.HMGB1蛋白在肝癌組織中高表達，在肝硬化組織中弱表達，而在正常肝組織中幾乎不表達，提示HMGB1可作為臨床肝癌檢測的重要腫瘤標志物;統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)HMGB1蛋白表達、性別、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和血清AFP值分別是影響肝癌生存預(yù)后的獨立因素。
　　 5.HMGB1基因與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是促進肝癌細胞增殖、遷移及侵襲