酪氨酸磷酸酶SHp-1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制研究.pdf

1、目的:
　　肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)，是世界上最常見的惡性腫瘤之一，雖然HCC的診斷及治療取得了很大進(jìn)展，但總體療效仍不容樂觀。
　　SHP-1(src-homology domain2-containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-1),是由PTPN6基因編碼的含有SH2結(jié)構(gòu)域的非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，可通過其去磷酸化作用影響細(xì)胞增

2、殖、分化、活性和凋亡。
　　本課題旨在通過對人肝癌標(biāo)本、體內(nèi)體外生物學(xué)效應(yīng)以及肝細(xì)胞特異性SHP-1基因敲除小鼠三個層面的研究來分析SHP-1對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響，并探索其作用機制。
　　方法:
　　一、SHP-1在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　1、SHP-1在肝癌及癌旁標(biāo)本中表達(dá)情況
　　2、SHP-1表達(dá)與臨床惡性表型關(guān)系
　　3、SHP-1與肝癌患者臨床預(yù)后關(guān)系
　　二、SHP-1對肝

3、癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用
　　1、SHP-1對肝癌細(xì)胞增殖的影響
　　2、SHP-1對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響
　　3、SHP-1對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響
　　4、SHP-1對肝癌細(xì)胞皮下成瘤能力的影響
　　5、SHP-1對肝原位種植瘤模型的治療作用
　　三、SHP-1對小鼠肝癌發(fā)生與發(fā)展的影響及其治療作用
　　1、驗證Ptpn6HKO小鼠肝臟中SHP-1表達(dá)情況
　　將Ptpn6f/f小鼠與

4、Alb-Cre小鼠雜交獲得可在肝細(xì)胞中特異性敲除SHP-1基因的Ptpn6HKO小鼠。對所有入組的小鼠于出生后第15天以及處死時進(jìn)行剪尾，并抽提鼠尾DNA，利用PCR檢測小鼠基因型。同時利用Western Blot檢測小鼠肝臟組織、分離的小鼠原代肝細(xì)胞、原代肝星狀細(xì)胞以及原代肝庫弗細(xì)胞中SHP-1蛋白表達(dá)是否與基因型相符，非肝細(xì)胞中SHP-1表達(dá)是否受影響。
　　2、肝細(xì)胞特異性缺失SHP-1后對小鼠DEN誘導(dǎo)肝癌形成及轉(zhuǎn)移的影響

5、
　　將小鼠按照基因型分為肝細(xì)胞特異性SHP-1敲除組和對照兩組(Ptpn6HKO和Ptpn6f/f)，按照體重分別在小鼠出生后第15天腹腔注射DEN(25μg/mg)，后每2月處死一批小鼠觀察肝臟腫瘤發(fā)生率、大小、數(shù)量以及肺轉(zhuǎn)移率等指標(biāo)，于小鼠出生后第11月終止實驗。
　　3、SHP-1對小鼠肝癌的治療作用
　　該部分利用DEN誘導(dǎo)Ptpn6HKO小鼠形成肝癌（劑量和方法同前），在出生后第10月將小鼠隨機分為2組各7

6、只，分別通過尾靜脈注射AdSHP-1和AdGFP(2×109pfu/100μl，2次/周，共3周)，最后一次尾靜脈注射病毒后一周處死小鼠，記錄小鼠體重、肝重、肝臟腫瘤大小、數(shù)量以及肺轉(zhuǎn)移發(fā)生情況，判斷SHP-1對小鼠肝癌的治療作用。
　　四、SHP-1抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制
　　1、通過siRNA或腺病毒調(diào)控肝癌細(xì)胞株(Huh7)中SHP-1的表達(dá)，利用WesternBlot檢測肝癌細(xì)胞中MAPK、JAK/STAT、NF

7、κB、PI3K/AKT等腫瘤相關(guān)信號通路的變化。
　　2、利用Western Blot檢測小鼠原代肝細(xì)胞中異常的信號通路，進(jìn)一步在體內(nèi)完善SHP-1抑制肝癌的機制。
　　五、統(tǒng)計學(xué)分析
　　研究數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩獨立樣本方差齊性數(shù)據(jù)采用Student'st檢驗;x2檢驗分析兩樣本率的比較;生存分析采用Kaplan-Meier分析和logrank檢驗;方差非齊性的配對資料采用Wilcoxon

8、符號秩檢驗，而不配對資料采用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異非常顯著。
　　結(jié)果:
　　一、SHP-1在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
　　1、SHP-1在肝癌及癌旁標(biāo)本中表達(dá)情況
　　在所檢測的136對肝癌組織標(biāo)本中，肝癌組織中SHP-1表達(dá)量顯著低于癌旁組織，且91.17％的肝癌組織SHP-1表達(dá)低于其對應(yīng)的癌旁組織，其中45.59％的肝癌組織SHP-1表達(dá)

9、下調(diào)超過2倍。
　　2、SHP-1表達(dá)與臨床惡性表型關(guān)系
　　根據(jù)上述肝癌標(biāo)本的Real-Time PCR結(jié)果，選取其中臨床資料完整的84例肝癌患者樣本，根據(jù)其癌組織中SHP-1表達(dá)量的中位數(shù)將這些標(biāo)本分為SHP-1低表達(dá)組和SHP-1高表達(dá)組。和高表達(dá)組相比，SHP-1低表達(dá)組肝癌患者年齡明顯偏小、AFP表達(dá)顯著升高、腫瘤更大、TNM分期更晚。以上結(jié)果說明SHP-1低表達(dá)的肝癌患者更早發(fā)生肝癌，且與腫瘤的惡性表型發(fā)生密切相

10、關(guān)。
　　3、SHP-1與肝癌患者臨床預(yù)后關(guān)系
　　按肝癌組織中SHP-1蛋白表達(dá)水平的中位數(shù)，將271例肝癌病人分為SHP-1低表達(dá)組及高表達(dá)組。根據(jù)肝癌患者臨床生存期資料分析SHP-1表達(dá)與肝癌患者總體生存期的關(guān)系。結(jié)果顯示SHP-1低表達(dá)組中肝癌患者總體生存期明顯低于高表達(dá)組。
　　二、SHP-1對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用
　　1、SHP-1抑制肝癌細(xì)胞增殖
　　通過AdSHP-1過表達(dá)SHP-1后，

11、肝癌細(xì)胞株Huh7和PLC的增殖能力明顯受到抑制，另一方面，siSHP-1下調(diào)Huh7及PLC兩株細(xì)胞中SHP-1表達(dá)量后則促進(jìn)其生長增殖能力。
　　2、SHP-1抑制肝癌細(xì)胞遷移能力
　　利用AdSHP-1腺病毒上調(diào)SHP-1表達(dá)的肝癌細(xì)胞株（Huh7和PLC）遷移能力明顯受到抑制，而siSHP-1轉(zhuǎn)染后其遷移能力得到明顯增強。
　　3、SHP-1抑制肝癌細(xì)胞侵襲能力
　　利用AdSHP-1腺病毒上調(diào)SHP-1

12、表達(dá)的肝癌細(xì)胞株（Huh7和PLC）侵襲能力明顯受到抑制，而siSHP-1下調(diào)SHP-1表達(dá)后其侵襲能力得到明顯增強。
　　4、SHP-1抑制肝癌細(xì)胞皮下成瘤能力
　　(1)將AdGFP或者AdSHP-1處理后的Huh7細(xì)胞注射于小鼠皮下，在注射種植后第19天，37.5％(3/8)的AdGFP組小鼠可觸及皮下腫瘤形成，第25天，AdGFP組所有小鼠皆形成皮下腫瘤(8/8)，但是AdSHP-1組小鼠直至第28天后才出現(xiàn)可觸及的

13、皮下腫瘤(3/8)，直至實驗截止時間（34天）AdSHP-1組也僅62.5％(5/8)小鼠形成皮下腫瘤。
　　(2)在所監(jiān)測的所有時間點，AdSHP-1組Huh7細(xì)胞皮下成瘤體積皆明顯小于AdGFP組。
　　(3) AdSHP-1組小鼠皮下成瘤大小和瘤重明顯低于AdGFP組，且腫瘤組織免疫組化結(jié)果顯示AdSHP-1處理后SHP-1明顯過表達(dá)，而生長指數(shù)蛋白Ki67表達(dá)和AdGFP組相比卻明顯下降。
　　5、SHP-1對

14、肝原位種植瘤模型有治療作用
　　將帶luc-Huh7細(xì)胞皮下成瘤組織種植于小鼠肝臟后，經(jīng)尾靜脈注射AdGFP或者AdSHP-1腺病毒觀察SHP-1對原位種植瘤模型治療作用。
　　(1)AdSHP-1組小鼠肝臟熒光信號值顯著低于對照AdGFP組，AdGFP組中兩只小鼠因瘤荷太大死亡。
　　(2)剝離肝臟瘤體也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SHP-1后明顯抑制了原位種植瘤的生長，瘤重顯著低于AdGFP組小鼠。
　　(3)免疫組化及Rea

15、l-Time PCR檢測證實AdSHP-1組小鼠肝臟瘤組織中SHP-1表達(dá)明顯高于對照AdGFP組。
　　三、SHP-1對小鼠肝癌發(fā)生與發(fā)展的影響及其治療作用
　　1、驗證Ptpn6HKO小鼠肝臟中SHP-1表達(dá)情況
　　鼠尾DNA抽提后PCR鑒定基因敲除鼠(Ptpn6HKO)與對照小鼠(Ptpn6f/f)基因型。同對照小鼠相比，Ptpn6HKO組小鼠肝組織中總SHP-1表達(dá)量明顯降低，且原代肝細(xì)胞中幾乎不表達(dá)SHP-

16、1，原代肝星狀細(xì)胞以及庫弗細(xì)胞中SHP-1的表達(dá)無明顯改變。以上結(jié)果提示Ptpn6HKO小鼠有且只有肝細(xì)胞不表達(dá)SHP-1。
　　2、肝細(xì)胞特異性缺失SHP-1后促進(jìn)小鼠DEN誘導(dǎo)肝癌形成及轉(zhuǎn)移
　　3、SHP-1對小鼠肝癌有治療作用
　　該部分利用DEN誘導(dǎo)Ptpn6HKO小鼠形成肝癌后通過尾靜脈注射AdGFP或者AdSHP-1，觀察SHP-1對肝癌的治療效果。
　　四、SHP-1抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制

17、r>　　(1) SHP-1能明顯抑制肝癌細(xì)胞JAK/STAT3、NFκB以及PI3K/AKT信號通路活化，對ERK以及p-38磷酸化水平無明顯影響。
　　(2) SHP-1缺失后，小鼠原代肝細(xì)胞中JAK/STAT3、NFκB和PI3K/AKT通路也明顯活化，ERK和p-38磷酸化水平亦無明顯改變。
　　結(jié)論:
　　1、SHP-1在肝癌組織中表達(dá)顯著降低，與肝癌患者臨床惡性表型以及臨床預(yù)后密切相關(guān)。
　　2、SHP