激活突變SHP-2酪氨酸磷酸酶對肝癌細胞惡性生物學行為的影響及其分子機制的探討.pdf

1、背景
　　肝癌是世界上三大引起死亡的癌癥之一,大約80％的肝癌患者是由肝炎病毒感染引起的,其中乙肝病毒攜帶者患肝癌的風險比正常人高5~15倍,大約有四分之一的乙肝病毒慢性感染者會發(fā)生肝硬化,每年有3%～8%乙肝病毒導致的肝硬化患者會惡化成肝癌。近年來越來越多的研究表明,SHP-2的激活突變及過度表達可能與實體瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關,但其在肝癌的發(fā)生、發(fā)展演化和轉(zhuǎn)移中的作用機制尚未明確。
　　SHP-2是一種蛋白酪氨酸磷酸酶(

2、ProteinTyrosinePhosphatase,PTP),廣泛表達于各種組織和細胞中,主要在各種造血細胞中高表達。SHP-2在N末端含有2個SH2(即Src同源體2)結(jié)構(gòu)域,C末端含有1個PTP催化結(jié)構(gòu)域及2個酪氨酸殘基(Tyr542和Tyr580)以及一個富含脯氨酸(Pro)的模體。每個SH2區(qū)都具有獨立的磷酸酪氨酸結(jié)合位點。生理狀態(tài)下N末端的SH2結(jié)構(gòu)域與PTP結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合抑制了SHP-2的催化活性,但在各種生長因子、干擾

3、素以及胰島素等刺激后,酪氨酸磷酸化的蛋白底物與SHP-2的兩個SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合,或SHP-2C端兩個酪氨酸位點磷酸化結(jié)合自身的SH2結(jié)構(gòu)域,暴露出PTP催化結(jié)構(gòu)域,從而使SHP-2蛋白去磷酸化活性得以恢復,發(fā)揮酪氨酸磷酸酶活性和接頭蛋白的功能。近年來,SHP-2激活突變在血液病方面研究已經(jīng)取得許多可喜的成績,另外SHP-2基因在實體瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越引起人們的關注。研究表明在部分肝癌細胞株中也能檢測到SHP-2是呈高水平表達的;

4、因此推測SHP-2可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了至關重要的作用。然而目前有關SHP-2與肝癌相關性研究很少有報道,本課題我們將對其進行研究。
　　方法
　　(1)本研究用成功構(gòu)建的SHP-2真核表達載體,轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2,篩選并鑒定了穩(wěn)定表達SHP-2的HepG2細胞株;
　　(2)檢測SHP-2激活突變及過表達對HepG2細胞增殖、克隆形成能力、凋亡和遷移侵襲的影響;
　　(3)分析SHP-2對肝癌細胞

5、惡性生物學行為影響的可能作用機制。
　　結(jié)果：
　　(1)成功的將SHP-2野生型及突變型真核表達載體轉(zhuǎn)染進HepG2細胞,挑取的單克隆細胞,經(jīng)Westernblot的篩選和鑒定,最終篩選出穩(wěn)定表達SHP-2的HepG2單克隆細胞株。
　　(2)SHP-2激活突變及過表達對肝癌細胞增殖和周期的影響:MTT結(jié)果顯示,未轉(zhuǎn)染的HepG2組和空載組細胞增殖速度接近,而突變組和過表達組增殖率明顯增加;平板克隆和軟瓊脂克隆形成實

6、驗結(jié)果表明突變組及過表達組單克隆細胞不僅數(shù)目多于對照組和空載體組,而且體積比對照組和空載體組大;細胞周期檢測顯示突變組和過表達組S期細胞增殖明顯快于對照組和空載組細胞。說明轉(zhuǎn)染SHP-2后增加了細胞的生長能力。
　　(3)SHP-2激活突變及過表達對肝癌細胞粘附能力和凋亡的影響:粘附實驗檢測結(jié)果顯示,突變及過表達組細胞粘附率高于對照組和空載體組;凱基Annexin-V/EGFP試劑盒檢測細胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變組及過表達組凋亡細胞均

7、明顯低于對照組和空載體組。說明轉(zhuǎn)染SHP-2增加了細胞的粘附和抗凋亡能力。
　　(4)SHP-2激活突變及過表達對肝癌細胞遷移和體外侵襲能力的影響:細胞劃痕和Transwell小室檢測細胞遷移法發(fā)現(xiàn),激活突變及過表達組細胞遷移率明顯高于空載體組和對照組;Transwell小室檢測細胞體外侵襲能力發(fā)現(xiàn),對照組和空載體組細胞的侵襲率明顯低于激活突變及過表達組。說明SHP-2具有增強HepG2細胞體外遷移和侵襲能力的作用。
　　(

8、5)轉(zhuǎn)染SHP-2突變型及野生型真核表達載體后CD133的表達情況:流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)SHP-2激活突變及過表達細胞中CD133的表達量明顯高于空載體組和對照組,說明轉(zhuǎn)染SHP-2能促進腫瘤干細胞的形成。
　　(6)SHP-2激活突變及過表達影響肝癌細胞惡性生物學行為可能機制:Westernblot檢測發(fā)現(xiàn),SHP-2激活突變及過表達組細胞磷酸化的AKT/ERK以及p38的水平明顯高于空載體組和對照組,表明轉(zhuǎn)染SHP-2可促進PI