激活突變的SHP-2酪氨酸酶對(duì)LOVO腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的影響及EMT探討.pdf

1、【背景】：
　　惡性腫瘤是威脅人類健康的重要疾病之一，近年來(lái)，惡性腫瘤呈現(xiàn)發(fā)病率升高和發(fā)病早齡化的趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)外的多種研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體里正常的細(xì)胞變成惡性細(xì)胞，需要機(jī)體內(nèi)外包括癌基因在內(nèi)的多種因素的作用，這個(gè)轉(zhuǎn)變過(guò)程是分多個(gè)階段逐步發(fā)生的復(fù)雜的長(zhǎng)期過(guò)程。人們對(duì)癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究已經(jīng)有多年研究。
　　結(jié)腸癌是西方國(guó)家常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是我國(guó)城市地區(qū)多發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。近二十年，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)一

2、直攀升。尤其在中國(guó)，結(jié)腸癌的發(fā)病率不低，而且死亡率也很高。然而結(jié)腸癌的病因和確切的分子機(jī)制還不完全清楚。
　　SHP-2(Src homology2-containing protein tyrosine phosphatase)是一種非受體型酪氨酸磷酸酶，會(huì)調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最開(kāi)始是在努南綜合征(Noonan syndrome)和白血病中發(fā)現(xiàn)了 SHP-2的突變，后來(lái)有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)在多種實(shí)體瘤中也發(fā)現(xiàn)了 SHP-2的突變，發(fā)

3、現(xiàn)SHP-2的突變?cè)趯?shí)體瘤中發(fā)揮了重要作用。SHP2-D61G的激活是SHP-2常見(jiàn)的激活突變之一，它會(huì)導(dǎo)致SHP-2中的結(jié)構(gòu)域部分解離，暴露其PTP結(jié)構(gòu)域的催化活性位點(diǎn)，從而導(dǎo)致SHP2酪氨酸磷酸酶活性的增強(qiáng)，進(jìn)而參與下游多條信號(hào)途徑的活化。
　　上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transitions)簡(jiǎn)稱 EMT，指在特定的病理生理情況下，具有極性的上皮細(xì)胞失去極性，向具有活動(dòng)能力的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變

4、并獲得侵襲和遷移能力，它的發(fā)生是多基因、多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程。EM T是誘發(fā)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的早期關(guān)鍵事件，其與胃腸道腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，有多種基因和分子均參與到EMT的發(fā)生過(guò)程中，其表型主要是上皮樣蛋白marker E-cadherin(E-鈣粘蛋白）的表達(dá)減少，和間質(zhì)樣蛋白marker表達(dá)的上調(diào)。結(jié)腸癌是上皮細(xì)胞腫瘤，在結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移中也會(huì)出現(xiàn)EMT。但 SHP2-D61G突變對(duì)結(jié)腸癌的增殖和迀移有是否有影響，在此過(guò)程中，是否

5、有EMT的發(fā)生尚未有明確報(bào)道。
　　綜合上述背景，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)方案來(lái)探索SHP2-D61G突變對(duì)結(jié)腸癌的增殖和迀移的影響，以及在此過(guò)程中，是否有EMT的發(fā)生。
　　【方法】：
　　(1)用 SHP-2+和 SHP-2D61G質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型。
　　(2)用 MTT，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LOVO細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后生長(zhǎng)情況。
　　(3)用粘附試驗(yàn)，劃痕試

6、驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LOVO細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后的迀移能力。
　?、欠治鲛D(zhuǎn)染前后細(xì)胞的EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，分析其與EMT相關(guān)性。
　　【結(jié)果】：
　　(1)成功構(gòu)建了 SHP-2+和 SHP-2D61G染的人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞模型。
　　(2) SHP-2D61G突變對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞生長(zhǎng)的影響： MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SHP_2D61G突變轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞增值率明顯增加；平板克隆實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)也表

7、明細(xì)胞的克隆形成率多于對(duì)照組。以上結(jié)果說(shuō)明SHP-2D61G突變促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的克隆形成與增殖能力。
　　(3)SHP-2D61G突變對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響：細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SHP-2D61t突變轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞的迀移速度明顯高于對(duì)照組。粘附實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的粘附能力和迀移能力明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明 SHP-2D61G突變有增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞體外迀移的能力。
　　(4)SHP-2D61G

8、突變導(dǎo)致了 EMT的發(fā)生：Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白marker， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHP-2D61　　【結(jié)論】：
　　(1)成功構(gòu)建了 SHP-2+和 SHP-2D61GR染后的LOVO細(xì)胞模型；
　　(2)SHP-2D61e促進(jìn)了 LOVO細(xì)胞增殖和迀移能力；
　　⑶ EMT在 SHP-2D61G對(duì)LOVO細(xì)胞生物