人肝素酶RNA干擾對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文人肝素酶RNA干擾對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響姓名：熊震申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：內(nèi)科學(xué)（消化系?。┲笇?dǎo)教師：楊仕明20071101第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文列，經(jīng)BLAST設(shè)計(jì)一組無(wú)關(guān)序列為陰性對(duì)照序列；設(shè)計(jì)包含干擾序列及無(wú)關(guān)序列的dsDNA并進(jìn)行生物合成；雙酶切pGenesil1質(zhì)粒；將合成的dsDNA克隆至酶切質(zhì)粒；測(cè)序鑒定后進(jìn)行質(zhì)粒抽提及純化。2培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，采用脂質(zhì)體法將各重組干擾質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

2、至HepG2細(xì)胞；G418抗性篩選3周；從各組細(xì)胞中挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。3采用RealTimeRTPcR和westemblot分別檢測(cè)干擾及未干擾的HepG2細(xì)胞肝素酶的表達(dá)，篩選有效的干擾序列。4采用不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)肝素酶RNA干擾后HepG2細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期、克隆形成能力、侵襲能力及體內(nèi)成瘤能力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1通過(guò)wwwgenscriptcom網(wǎng)站的0nlinet001s找到三條肝素酶干擾序列，分別為：No1(1214—1

3、232)：5’一GGETATCTCTTCTGTTCAA一3’，No2(167185)：57TCCTGTCCGTCACCATTGA3’，No3(611—629)：5’一CTCAGTTGCTCCTGGACTA3’，及陰性對(duì)照序列5’一ACTACCGTTGTATAGGTGT一37；并成功將包含各干擾序列及陰性對(duì)照序列的dsDNA克隆至質(zhì)粒pGenesil1，經(jīng)測(cè)序鑒定后，證實(shí)所連入的序列與設(shè)計(jì)序列一致，分別命名為pGenesil一1／Hpa／

4、siRNA一1、pGenesil—1／Hpa／siRNA一2、pGenesil—l／Hpa／siRNA一3、pGenesil—1／Hp“siRNA—N。2采用脂質(zhì)體法將上述各組干擾質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至HepG2肝癌細(xì)胞當(dāng)中，經(jīng)G418抗性篩選后，得到陽(yáng)性克?。粩U(kuò)大培養(yǎng)后各細(xì)胞株分別命名為HepG2／RNAi／11、HepG2／RNAi／2—2、HepG2／RNAi／3一l、HepG2／RNAi／3—3、HepG2／RNAi／N。3RealTi

5、meRTPCR結(jié)果表明，干擾組HepG2瓜NAi／11、HepG2依NAi／22及HepG2瓜NAi／3—3中Hpa在mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，而HepG2瓜NAi／3一l中的Hpa表達(dá)與陰性對(duì)照組和HepG2組無(wú)差別；westernblot檢測(cè)結(jié)果表明HepG2瓜NAi／11與HepG2瓜NAi／3—3兩組中Hpa蛋白表達(dá)水平較HepG2組和HepG2瓜NAi／N組顯著下調(diào)，抑制效率分別達(dá)到57％、71％。4采用westemblot檢

6、測(cè)不同代數(shù)干擾細(xì)胞肝素酶的表達(dá)，結(jié)果表明，在10代以前，Hpa／siRNA1和Hp眺iRNA3可以有效抑制HepG2肝癌細(xì)胞肝素酶蛋白的表達(dá)。5MTT實(shí)驗(yàn)表明HepG2瓜NAi／1—1與HepG2／RNAi／33組細(xì)胞增殖能力明顯低于HepG2組和HepG狐NA淵組；平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)表明HepG2瓜NAi／11與HepG2／ItNAi／33組單個(gè)細(xì)胞形成克隆的能力與HepG2組和HepG2瓜NAi／N組相比顯著降低(344，265vJ1