ERK1小干擾RNA對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 原發(fā)性肝癌(PHC)是指由肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤。肝細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)(Hcc)是其中最常見的組織學(xué)類型，占肝臟腫瘤的80％～90％。肝癌的全球發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，在所有惡性腫瘤中位列第五，而其死亡率為第三位。盡管近年來肝癌的診治己取得較大進(jìn)展，但其預(yù)后仍不理想，臨床迫切需要尋找新的治療方案。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一類廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的高度保守的絲氨酸和蘇氨酸

2、蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERKs)是其重要成員之一，參與了包括肝細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等病理生理過程。有研究表明，ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在HCC中過度活化，且ERK通路活化的HCC患者相對(duì)ERK表達(dá)陰性的患者預(yù)后更差，因此，抑制ERK的表達(dá)可能成為治療肝癌的新靶點(diǎn)。
　　 木課題旨在探討ERK1小干擾RNA(siRNA)對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響及其可能的作用機(jī)制。
　　

3、 [實(shí)驗(yàn)方法]
　　 一、檢測(cè)人肝癌標(biāo)本及大鼠肝癌細(xì)胞株中ERK1的表達(dá)
　　 (一)肝癌組織中ERK1表達(dá)
　　 選擇12例人肝癌手術(shù)切除標(biāo)木，以癌旁肝組織做為對(duì)照，免疫組化法檢測(cè)ERK1表達(dá)及定位情況。
　　 在二乙基亞硝胺(diethylinitrosamine，DEN)誘導(dǎo)大鼠肝癌形成的過程中，取不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝組織，免疫組化法檢測(cè)ERK表達(dá)及定位情況。
　　 (二)大鼠肝癌細(xì)胞株中ERK

4、1表達(dá)
　　 培養(yǎng)大鼠肝癌細(xì)胞株RH-35及H4IIE，抽取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以正常大鼠原代肝細(xì)胞為對(duì)照，RT-PCR檢測(cè)大鼠ERK1mRNA水平表達(dá)情況。
　　 二、重組復(fù)制缺陷型腺病毒AdshERK1構(gòu)建、鑒定及擴(kuò)增
　　 從pSuper質(zhì)粒上雙酶切得到ERK1shRNA目的片段，將目的片段與pShuttle-GFP-H1-neo質(zhì)粒連接，獲得穿梭質(zhì)粒pShuttle-GFP-H1-shERK1，該

5、質(zhì)粒與pAdEasy-1質(zhì)粒同源重組后篩選獲得pAdshERK1。PacI酶酶切質(zhì)粒pAdshERK1使其線性化后，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞進(jìn)行包裝，獲得腺病毒AdshERK1。以同樣方法構(gòu)建空白對(duì)照病毒AdshNC。用AdshERK1感染肝癌細(xì)胞H4IIE，Westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞中ERK1蛋白水平表達(dá)。
　　 擴(kuò)增高效表達(dá)ERK1siRNA的腺病毒AdshERK1和對(duì)照病毒AdshNC，測(cè)定病毒滴度，-80℃冰箱中保存。<

6、br>　　 三、AdshERK1對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響
　　 (一)AdshERK1對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　 1.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　 將大鼠肝癌細(xì)胞株RH-35、H4IIE分至96孔板，設(shè)置AdshERK1感染組、對(duì)照病毒AdshNC感染組和空白對(duì)照組。Cellcountingkit8(CCK8)法檢測(cè)細(xì)胞在波長(zhǎng)為450nm時(shí)的光密度值(OD值)，連續(xù)檢測(cè)6天，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　 2.克隆形

7、成實(shí)驗(yàn)
　　 將感染腺病毒AdshERK1、AdshNC的RH-35、H4IIE細(xì)胞分至35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(400個(gè)細(xì)胞/皿)，當(dāng)細(xì)胞分裂至肉眼可見的克隆時(shí)，用考馬斯亮藍(lán)染色，拍照并分析AdshERK1對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　 3.流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期
　　 腺病毒AdshERK1、AdshNC感染大鼠肝癌細(xì)胞株RH-35、H4IIE，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

8、變化。
　　 (二)AdshERK1對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響
　　 1.劃痕實(shí)驗(yàn)
　　 將大鼠肝癌細(xì)胞RH-35、H4IIE分至35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度達(dá)95％后，用200ul槍頭在細(xì)胞單層上劃痕，PBS洗掉脫落細(xì)胞，用腺病毒AdshERK1、AdshNC分別感染細(xì)胞，顯微鏡下觀察AdshERK1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 2.transwell遷移實(shí)驗(yàn)
　　 將RH-35、H4IIE細(xì)胞

9、分至六孔板，分別感染腺病毒AdshERK1、AdshNC，24h后收集細(xì)胞種植于transwell小室，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，去除小室上層未遷移細(xì)胞，0.5％結(jié)晶紫溶液固定染色下層細(xì)胞，顯微鏡下觀察，評(píng)估AdshERK1對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力影響。
　　 3.重組基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)
　　 將RH-35、H4IIE細(xì)胞分至六孔板，分別感染腺病毒AdshERK1、AdshNC，24h后收集細(xì)胞種植于包被有matrigel的

10、transwell小室，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，去除小室上層未遷移細(xì)胞，結(jié)晶紫固定染色下層細(xì)胞，顯微鏡下觀察，評(píng)估AdshERK1對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力影響。
　　 (三)AdshERK1對(duì)腫瘤細(xì)胞成瘤能力的影響
　　 將分別感染腺病毒AdshERK1、AdshNC的大鼠肝癌細(xì)胞H4IIE接種于裸鼠皮下，左右兩側(cè)分別為AdshERK1組、AdshNC組，每周兩次觀察腫瘤生長(zhǎng)情況并測(cè)量大小，觀察AdshERK1對(duì)大鼠肝

11、腫瘤細(xì)胞成瘤性的影響。
　　 (四)AdshERK1對(duì)ERK1下游腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 腺病毒AdshERK1、AdshNC感染大鼠肝癌細(xì)胞株RH-35、H4IIE72h、96h后收集細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)ERK1及其下游基因癌基因c-mycmRNA表達(dá)。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)以X±SD表示，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。P<0.05明數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01說明數(shù)據(jù)

12、有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　 一、ERK1在肝癌組織及大鼠肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)
　　 (一)肝癌組織中ERK1表達(dá)上調(diào)
　　 免疫組化顯示，11例肝癌組織ERK1表達(dá)較其相應(yīng)癌旁組織明顯上調(diào)，另1例肝癌組織ERK1表達(dá)無明顯差別。
　　 免疫組化顯示，在DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌模型中，隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠肝臟中ERK表達(dá)逐漸升高。
　　 (二)大鼠肝癌細(xì)胞株中ERK1表達(dá)上調(diào)

13、r>　　 RealtimeRT-PCR結(jié)果顯示，在大鼠肝癌細(xì)胞株RH-35、H4IIE中ERK1表達(dá)均顯著上調(diào)(RH-35，H4IIEvsnormal，P<0.01)。
　　 二、成功構(gòu)建重組復(fù)制缺陷型腺病毒AdshERK1
　　 用293A細(xì)胞包裝的腺病毒AdshERK1感染肝癌細(xì)胞H4IIE，Westernblot法檢測(cè)ERK1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示其表達(dá)明顯下調(diào)，表明腺病毒AdshERK1構(gòu)建成功。
　　 三

14、、AdshERK1對(duì)大鼠肝癌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響
　　 (一)AdshERK1抑制腫瘤細(xì)胞增殖及克隆形成能力
　　 1.AdshERK1抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力
　　 將AdshERK1、AdshNC感染RH-35或H4IIE，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞在波長(zhǎng)450nm時(shí)的光密度值(OD值)，連續(xù)檢測(cè)6天，繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果示AdshERK1顯著抑制大鼠肝癌細(xì)胞增殖，且該抑制作用呈時(shí)間依賴性。AdshERK1感染6天時(shí)，RH

15、-35細(xì)胞中AdshERK1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率達(dá)37％(P<0.01，Student'sttest)；H4IIE細(xì)胞中，AdshERK1對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率達(dá)46％(P<0.05，Student'sttest)。
　　 2.AdshERK1抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成能力
　　 將感染AdshERK1、AdshNC病毒的RH-35或H4IIE細(xì)胞分至35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，AdshERK1感染10天左右染色固定細(xì)胞，觀察兩組克隆數(shù)量差

16、別，結(jié)果示腺病毒AdshERK1可以顯著減弱大鼠肝癌細(xì)胞的克隆形成能力(P<0.05，Student'sttest)。
　　 3.AdshERK1引起細(xì)胞周期阻滯
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果示AdshERK1使大鼠肝癌細(xì)胞的S期細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。RH-35細(xì)胞中，AdshERK1組G0/G1時(shí)相細(xì)胞較AdshNC組顯著增多(89.57％±1.26％vs76.77％±0.93％，P<0

17、.01)，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較AdshNC組顯著減少(4.39％±0.85％vs18.55％±4.80％，P<0.01)；H4IIE細(xì)胞中，AdshERK1組G0/G1時(shí)相細(xì)胞較AdshNC組增多(61.18％±0.29％vs56.61％±0.54％)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較AdshNC組減少(24.29％±0.10％vs29.04%±0.59％)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (二)AdshERK1抑制腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲能力

18、>　　 1.AdshERK1抑制腫瘤細(xì)胞遷移能力
　　 將大鼠肝癌細(xì)胞RH-35、H4IIE分至35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，用200μl槍頭在細(xì)胞單層上劃痕，顯微鏡下觀察AdshERK1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果示AdshERK1可顯著抑制細(xì)胞的遷移能力(P<0.05)。
　　 將RH-35、H4IIE細(xì)胞分至六孔板，分別感染腺病毒AdshERK1、AdshNC，24h后種植于transwell小室，48h后去除小室上層未遷移

19、細(xì)胞，0.5％結(jié)晶紫溶液固定染色下層細(xì)胞，顯微鏡下觀察小室下層遷移細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果示AdshERK1組細(xì)胞的遷移能力受到顯著抑制(P<0.01)。
　　 2.AdshERK1抑制腫瘤細(xì)胞侵襲能力
　　 將RH-35、H4IIE細(xì)胞分至六孔板，分別感染腺病毒AdshERK1、AdshNC，24h后種植于包被有matrigel的transwell小室，48h后結(jié)晶紫固定染色下層細(xì)胞，顯微鏡下觀察小室下層遷移細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果示Ad

20、shERK1組細(xì)胞的侵襲能力受到顯著抑制(P<0.01)。
　　 (三)AdshERK1顯著抑制腫瘤細(xì)胞成瘤能力
　　 將分別感染腺病毒AdshERK1、AdshNC的大鼠肝癌細(xì)胞H4IIE接種于裸鼠皮下，每周觀察腫瘤生長(zhǎng)情況兩次并測(cè)量大小。細(xì)胞感染AdshNC后7d皮下即可觸及腫瘤，21d后6只小鼠均可觸及腫瘤生長(zhǎng)；AdshERK1組接種10d后皮下可觸及腫瘤，21d后3/6只小鼠可觸及腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤重量較AdshNC

21、組顯著減小(P<0.01)。
　　 (四)AdshERK1對(duì)ERK1下游腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 RT-PCR結(jié)果示RH-35、H4IIE細(xì)胞感染AdshERK172h及96h后ERK1及其下游癌基因c-myc的表達(dá)顯著下調(diào)(RH-35，P<0.01；H4IIE，P<0.01)
　　 [結(jié)論]
　　 一、ERK1在肝癌組織及大鼠肝癌細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)。
　　 二、構(gòu)建的腺病毒AdshERK1可顯