小干擾RNA沉默YAP基因?qū)θ搜乐苣じ杉?xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、牙周膜是一個(gè)自我更新的系統(tǒng)，牙周組織中存在一種原始的、可產(chǎn)生不同表型的間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，后將其命名為牙周膜干細(xì)胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）。自2004年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，PDLSCs即引起口腔界地極大關(guān)注，它除具有干細(xì)胞基本特性外，還具有形成骨樣、牙骨質(zhì)樣及牙周韌帶樣結(jié)構(gòu)組織的特性，越來(lái)越多地研究證實(shí)PDLSCs在維持牙周組織動(dòng)態(tài)平衡和

2、缺損修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，PDLSCs被認(rèn)為是牙周組織工程中最具有潛力的種子細(xì)胞。然而，PDLSCs的組織來(lái)源少，體外擴(kuò)增極易老化，并且增殖活性和分化潛能受供體年齡和身體狀況等多種因素的影響，這使PDLSCs的研究應(yīng)用受到極大限制。
　　干細(xì)胞生命活動(dòng)受多種信號(hào)通路的調(diào)控，在不同的時(shí)間空間條件下，干細(xì)胞有絲分裂可能會(huì)走向老化、凋亡、分化等不同的命運(yùn)。Hippo信號(hào)通路是新近發(fā)現(xiàn)的一種與控制器官大小和腫瘤形成有關(guān)的蛋白激酶級(jí)聯(lián)通

3、路，YAP(Yes-associated protein)是此通路中一個(gè)重要的信號(hào)蛋白，Hippo上游分子主要通過(guò)調(diào)控YAP活性從而介導(dǎo)不同的生物學(xué)功能。YAP在多種組織干細(xì)胞和前體細(xì)胞中均見(jiàn)有高表達(dá)，在維持干細(xì)胞特性、促進(jìn)細(xì)胞自我更新方面發(fā)揮重要作用。已有研究表明Hippo信號(hào)通路參與小鼠牙齒發(fā)育過(guò)程，改變牙源性上皮細(xì)胞YAP的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致牙齒形態(tài)發(fā)生和結(jié)構(gòu)的異常，目前尚未見(jiàn)YAP對(duì)PDLSCs作用的相關(guān)報(bào)導(dǎo)與研究。
　　此外，H

4、ippo信號(hào)通路和與形態(tài)發(fā)生相關(guān)的TGF-β、Writ等信號(hào)通路存在多種交叉會(huì)話，各通路之間信號(hào)傳遞從而組成一種高度復(fù)雜而有序地的信息網(wǎng)絡(luò)，從而有序協(xié)調(diào)地調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)。目前關(guān)于PDLSCs的細(xì)胞生物學(xué)特性調(diào)控機(jī)制尚不十分明確。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)擬采用小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)沉默人牙周膜干細(xì)胞(Human-periodontal ligament stem cells，h-P

5、DLSCs) YAP基因，研究YAP基因沉默對(duì)hPDLSCs增殖、凋亡及成骨向分化等生物學(xué)行為的影響。
　　材料和方法：
　　1.原代h-PDLSCs的獲取經(jīng)酶解組織塊法分離、有限稀釋克隆法純化、流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記;擴(kuò)大培養(yǎng)。
　　2.設(shè)計(jì)并化學(xué)合成siRNA序列，非特異性序列一條、人YAP靶向siRNA序列三條，以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000為載體將siRNA序列轉(zhuǎn)入h-PDLSCs，分別

6、設(shè)為NC(Negative Control)、siRNA-1、2、3組，僅使用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體干預(yù)組設(shè)為空白組。采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后YAP表達(dá)水平。
　　3.分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)，使用細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒

7、(CCK-8)檢測(cè)YAP-siRNA對(duì)h-PDLSCs增殖活性的影響;于轉(zhuǎn)染后72h使用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒流式檢測(cè)分析siRNA干擾后細(xì)胞周期分布，并檢測(cè)YAP下游轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞增殖與皮間轉(zhuǎn)化信號(hào)等相關(guān)的靶基因——結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(Connective tissue growth factor，CTGF)表達(dá)水平。
　　4.于轉(zhuǎn)染后72h，使用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA干擾后細(xì)胞凋亡率的變化。
　　5.采用RT

8、-PCR技術(shù)檢測(cè)YAP-siRNA干擾后h-PDLSCs成骨相關(guān)基因(RUNX2、OCN、ALP、CollagenⅠ)的表達(dá)水平。
　　6.采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)表面標(biāo)記:MSCs表面標(biāo)記CD73+、CD44+等(98％～99.4％)，造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD45-、HLA-DR等-（0.28±0.012％），本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)獲得細(xì)

9、胞為h-PDLSCs;在YAP-siRNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，siRNA-1組、siRNA-2組與空白組和NC組相比，h-PDLSCs的YAP mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P＜0.01)，且蛋白表達(dá)水平在被轉(zhuǎn)染后48、72小時(shí)之間無(wú)顯著差異，另外，這表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成的siRNA-1、siRNA-2序列可以持續(xù)特異有效地抑制YAP的表達(dá);CCK-8增殖活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA-1、siRNA-2組細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制，流式細(xì)胞儀

10、檢測(cè)結(jié)果顯示siRNA-1、siRNA-2組h-PDLSCs細(xì)胞周期也發(fā)生改變——G0/G1及S期細(xì)胞比例增多(P＜0.01)、G2期細(xì)胞比例明顯減少(P＜0.05)，YAP下游靶基因CTGF蛋白表達(dá)量也降低;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示siRNA-1、siRNA-2組h-PDLSCs早期及晚期凋亡率均增加;YAP-siRNA轉(zhuǎn)染后h-PDLSCs成骨相關(guān)基因(CollagenⅠ、ALP、OCN)的mRNA表達(dá)水平顯著升高，尤以O(shè)CN最

11、為明顯。
　　結(jié)論：
　　siRNA沉默YAP基因后h-PDLSCs增殖活性降低，細(xì)胞周期分布發(fā)生改變——被阻滯于G0/G1及S期，h-PDLSCs凋亡率明顯增加，由此可見(jiàn)，h-PDLSCs表達(dá)的YAP可促進(jìn)h-PDLSCs增殖并抑制凋亡。此外，細(xì)胞增殖活性的改變可能與細(xì)胞周期被阻滯、細(xì)胞凋亡率增加有關(guān)，我們還推測(cè)YAP下游靶基因CTGF在這一過(guò)程中介導(dǎo)重要功能但需進(jìn)一步驗(yàn)證;在YAP基因沉默后h-PDLSCs高表達(dá)成骨分化