RNA干擾抑制c-Met基因表達對人喉癌Hep-2細胞生物學行為的作用.pdf

1、第三軍醫(yī)大學碩士學位論文RNA干擾抑制cMet基因表達對人喉癌Hep2細胞生物學行為的作用姓名：謝治年申請學位級別：碩士專業(yè)：耳鼻咽喉科學指導教師：姬長友20090501第三軍醫(yī)人學碩十學位論文經雙酶切后的載體Psilencer20U6連接，構建攜帶此shRNA的重組質粒pSilencer2O，cMet—shRNA，轉化DH5Q菌株，提取質粒行酶切鑒定，并進行序列測定。2利用構建成功的重組質粒，通過脂質體介導的方法將其轉染到喉癌Hep2

2、細胞株中。采用RTPCR及westem—Blot法檢測c—MetmRNA及蛋白表達情況，比較轉染前后其表達的變化，判斷各shRNA的干擾效應；篩選出抑制效果最好的c—MetsiRNA序列。3通過四甲基偶氮嘩藍(MTT)法(取轉染后細胞生長24h、48h、72h、96h四個時間點)、運動實驗及侵襲實驗(通過構建transwell小室)比較重組質粒轉染Hep一2細胞前后細胞的生長、運動及侵襲能力。結果：1重組質粒轉化DH5Q菌株經氨卞青霉素

3、抗性篩選可見有細菌克隆長出。2雙酶切鑒定顯示重組質粒含有BamHI及HindIII酶切位點。3經測序，模板序列與設計序列完全正確，重組質粒構建成功。4通過脂質體轉染三種干擾質粒后，RTPcR法檢測cMet基因的mRNA表達水平，顯示三組均下調，以重組質粒pSilencer2O／c—Met—shRNA2效應最顯著(p=O003)。5經WestemBlot法檢測，通過脂質體轉染三種干擾質粒后，c—Met蛋白的表達水平均下調，以重組質粒pSi

4、lencer20，cMetshRNA2效應最顯著(p=O02)。6psilencer20／cMetshRNA2轉染Hep一2細胞后，相對于未轉染組及空質粒轉染組，細胞在培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后的吸光度A492值均顯著下降(pO05)。7pSilencer2O／cMetshRNA2轉染Hep2細胞后，相對于未轉染組及空質粒轉染組，侵襲細胞計數(shù)為15oo36l(p值均=O004)，趨化運動細胞計數(shù)為7267473(分另IJ為p=

5、OOOl，p=0004)。結論：1成功構建了針對cMet基因的重組RNAi質粒pSilencer2O紀一Met—shRNAl、pSilencer2o／c—MetshRNA2、pSilencer2o／c—MetshRNA3。2重組質粒pSjJencer2。O／cMet—shRNA2可明顯降低喉癌Hep2細胞cMet基因在mRNA和蛋白水平的表達。3重組質粒pSilencer20／c—Met—shRNA2能顯著抑制喉癌Hep一2細胞的生長、