siRNA干擾β-catenin基因?qū)戆〩ep-2細(xì)胞增殖、凋亡和順鉑化療耐藥的影響.pdf

1、喉癌是臨床上常見的惡性腫瘤疾病之一，其生長(zhǎng)速度快,具有較強(qiáng)的侵襲力，中晚期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，已成為嚴(yán)重威脅人類生命和健康的疾病。目前主要采用手術(shù)結(jié)合放療、化療以及生物治療等綜合治療手段。然而，喉癌對(duì)化療藥物敏感度低、抵抗力強(qiáng)，一直是喉癌治療的一大難題。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜，是在多種因素影響下，由多種基因和多條信號(hào)通路在不同階段作用的結(jié)果。現(xiàn)階段的研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的經(jīng)典途徑之一，若其傳

2、導(dǎo)障礙則引起細(xì)胞生長(zhǎng)、分化異常，從而引發(fā)腫瘤的形成。
　　Wnt基因是細(xì)胞外分泌的一組糖蛋白家族，目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了19種 Wnt基因及多種 Wnt受體[1]。Wnt信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與了多種胚胎的發(fā)育過程。其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、黏附、遷移和極性等，在機(jī)體發(fā)育及各種生理過程中起著重要的作用。主要分為經(jīng)典的和非經(jīng)典的 Wnt信號(hào)通路，前者依賴于β-catenin蛋白的作用，后者主要依賴于細(xì)

3、胞極性（PCP）和Ca2+信號(hào)通路。
　　β-catenin是經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路的核心成分，是一個(gè)多功能的蛋白基因，定位于染色體3q21.3－p22，由16個(gè)外顯子組成，在果蠅中稱 Armadillo基因，是進(jìn)化上保守的分子，在動(dòng)物的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮了重要作用[2-3]。除了作為一種細(xì)胞骨架蛋白，與 E-cadherin和α-catenin形成粘附復(fù)合體，參與細(xì)胞黏附。β-catenin還是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

4、,廣泛存在于各種類型的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞中，在參與這些細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。
　　第一部分 siRNA干擾β-catenin基因?qū)戆〩ep-2細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響
　　目的：應(yīng)用小分子干擾 RNA干擾β-catenin基因在喉癌 Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)，探討干擾β-catenin基因后對(duì)喉癌 Hep-2細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響。
　　方法：RNA干擾技術(shù)干擾

5、喉癌 Hep-2細(xì)胞β-catenin基因的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)分為 siRNA-β-catenin-Hep-2干擾組，β-catenin-Neg陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR、Western-blot方法檢進(jìn)行干擾效果鑒定；采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、流式細(xì)胞儀 AnnexinPI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、transwell法觀察細(xì)胞的遷移侵襲能力。
　　結(jié)果：qPCR結(jié)果表明β-catenin-siRNA干擾組 mRNA相對(duì)表達(dá)

6、量較空白對(duì)照組下降達(dá)70％，western blot結(jié)果顯示干擾組β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.545±0.111）較空白對(duì)照組（1.507±0.139）和陰性對(duì)照組（1.429±0.089）明顯下降(F=21.859，P<0.05)，表明干擾了β-catenin基因在喉癌 Hep-2細(xì)胞中的表達(dá)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾β-catenin基因表達(dá)導(dǎo)致喉癌細(xì)胞增殖明顯受抑制(P<0.01)，流式細(xì)胞儀 AnnexinPI法檢測(cè)說明

7、，β-catenin-siRNA干擾組凋亡率（18.80±0.81）%與空白對(duì)照組（8.6±0.68）%和陰性對(duì)照組（9.03±0.26）%相比明顯增加（F=253.9，P<0.01）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察到β-catenin-siRNA干擾組穿過 Matrigel基質(zhì)膠到達(dá)下室的平均細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組均明顯減少(F=136.20，P<0.01)。
　　結(jié)論：干擾β-catenin基因在喉癌Hep-2中的表達(dá)

8、可抑制喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖和侵襲能力，促進(jìn)喉癌Hep-2細(xì)胞的凋亡。
　　第二部分 siRNA干擾β–catenin基因表達(dá)后喉癌 Hep-2細(xì)胞對(duì)順鉑化療敏感性的研究
　　目的：探討siRNA干擾β–catenin基因表達(dá)后喉癌Hep-2細(xì)胞對(duì)順鉑化療敏感性的變化。
　　方法：利用RNA干擾技術(shù)干擾喉癌 Hep-2細(xì)胞β-catenin基因，RT-PCR和Western-blot從 mRNA和蛋白水平檢測(cè)目的基因

9、干擾效果;實(shí)驗(yàn)分為siRNA-β-catenin-Hep-2干擾組，β-catenin-Neg陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組；MTT法檢測(cè)不同濃度順鉑對(duì)三組細(xì)胞的增殖抑制率并計(jì)算半數(shù)抑制有效藥物濃度IC50值，流式細(xì)胞儀檢查三組細(xì)胞相同濃度順鉑刺激后凋亡率的變化。
　　結(jié)果：①通過半數(shù)抑制濃度(IC50)計(jì)算軟件得出順鉑對(duì)三組細(xì)胞的 IC50值，β-catenin-RNAi干擾組 IC50是(5.81±0.46)μg/mL，得出順鉑對(duì)空白

10、對(duì)照組的IC50是(10.10±1.01)ug/mL，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。②流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，β-catenin-RNAi干擾組細(xì)胞凋亡率為（26.15±0.60）%明顯高于空白對(duì)照組細(xì)胞的（14.16±0.05）% t＝19.856 P<0.05。
　　結(jié)論：干擾β-catenin的表達(dá)能有效增強(qiáng)喉癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性，與順鉑協(xié)同促進(jìn) Hep-2細(xì)胞的凋亡。這為進(jìn)一步研究喉癌化療耐藥機(jī)