XIAP反義寡脫氧核苷酸誘導(dǎo)喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡及對順鉑化療的增敏作用.pdf

1、目的： 通過XIAP反義寡脫氧核苷酸(ASODN)轉(zhuǎn)染喉癌Hep--2細(xì)胞株探討對Hep-2細(xì)胞株增殖、凋亡、及化療敏感性的影響。 方法： 首先在37℃，5％CO<,2>，20％O<,2>和95％濕度條件下的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep--2細(xì)胞，取指數(shù)生長期細(xì)胞，分別用于以下各步實驗。 1、反義寡脫氧核苷酸轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染率的測定：取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染法分別介導(dǎo)4

2、個濃度梯度的XIAP反義寡脫氧核苷酸100，200，400，600nmol進(jìn)入細(xì)胞。取轉(zhuǎn)染后6小時細(xì)胞于熒光倒置顯微鏡下觀察。 2、MTT法檢測不同濃度順鉑作用Hep-2細(xì)胞24小時后對細(xì)胞增殖的抑制情況，RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)檢測順鉑作用Hep-2細(xì)胞24小時后細(xì)胞凋亡以及XIAP mRNA、XIAP蛋白的表達(dá)情況。 3、MTT法檢測基因轉(zhuǎn)染前后聯(lián)合順鉑作用對Hep-2細(xì)胞增殖的抑制情況：取對數(shù)生長期Hep-2細(xì)胞

3、進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將實驗分成以下幾組：Ⅰ組：以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染復(fù)合物作為空白對照；Ⅲ：脂質(zhì)體對照組；Ⅲ組：轉(zhuǎn)染ASODN組，設(shè)四個濃度100、200、400、600nmol/ml；Ⅳ組：轉(zhuǎn)染SCODN組，設(shè)四個濃度100、200、400、600nmol/ml：以上四組又分為3ug/ml順鉑(DDP)作用組及無順鉑組，每組設(shè)3個平行孔，置37℃，5％CO<,2>，20％O<,2>培養(yǎng)箱中孵育18h--24h至細(xì)胞85％--9

4、0％匯板進(jìn)行轉(zhuǎn)染，加化療藥組于轉(zhuǎn)染后6小時加入DDP使其終濃度為3ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于轉(zhuǎn)染后12、24、36、48小時，在培養(yǎng)細(xì)胞中加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，繼續(xù)孵育4h后小心去除原孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入甲臢溶解液(SDS溶液)100μl/孔，放于振蕩器連續(xù)振蕩10min后于酶標(biāo)儀中檢測光密度(0D)值。 4、RT--PCR法檢測基因轉(zhuǎn)染前后聯(lián)合順鉑作用XIAPmRNA的表達(dá)情況：取對數(shù)生長期Hep--2細(xì)胞進(jìn)

5、行轉(zhuǎn)染，將實驗分成四組，Ⅰ組：空白對照組；Ⅱ組：脂質(zhì)體對照組；Ⅲ組：200nmol/LASODN轉(zhuǎn)染組；Ⅳ組：200nmol/L SCODN轉(zhuǎn)染組；以上四組又分為3ug/ml DDP作用組及無DDP組，每組設(shè)3個平行孔，基因轉(zhuǎn)染后36小時收集1×10<'7>個細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA。分別取等量RNA采用20ul反應(yīng)體系按照cDNA試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后取5ul逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物以1.5％瓊

6、脂糖凝膠電泳，紫外線燈下觀察并照相。 5、流式細(xì)胞儀檢測基因轉(zhuǎn)染前后聯(lián)合順鉑作用對細(xì)胞凋亡率及XIAP蛋白表達(dá)的影響。實驗分組NRT-PCR，每組設(shè)3個平行孔。取對數(shù)生長期Hep-2細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后置37℃， 5％CO<,2>，20％O<,2>培養(yǎng)箱中孵育至36小時，收獲細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，送流式細(xì)胞儀檢測。 結(jié)果： 1、XIAP反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染Hep-2的轉(zhuǎn)染情況及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變在熒光倒置顯微鏡下觀

7、察發(fā)現(xiàn)各濃度的反義寡核苷酸(100nmol/1-600nmol/1)實驗組Hep-2細(xì)胞形態(tài)有不同程度的改變，表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞皺縮，核固縮，胞漿粗糙和分裂相少見等。而正常對照Hep-2細(xì)胞形態(tài)完整，貼壁生長良好。各濃度帶FITC標(biāo)記的XIAP反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞后6小時于熒光顯微鏡下觀察均可見綠色熒光，熒光分布主要積聚于細(xì)胞核內(nèi)，同時細(xì)胞漿中也有較強(qiáng)的熒光分布。其平均轉(zhuǎn)染效率在終濃度為100nmol/L、200nmo

8、l/L、400nmol/L、600nmol/L分別為(95±2.1)％、(98±1.3)％、(96±2.6)％、(93±3.0)％，方差分析顯示組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而對照組未見轉(zhuǎn)染現(xiàn)象。(見Fig.1)。 2、不同濃度的順鉑(1ug/ml～5ug/ml)作用24小時后均對細(xì)胞增殖有抑制作用，并隨劑量的增加抑制率逐漸增大(P<0.05)，細(xì)胞抑制率在3ug/ml時明顯增加，以5ug/mlDDP組抑制率最大(16.

9、72±0.81)％，2ug/mlDDP組與3ug/mlDDP組有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。細(xì)胞凋亡率隨DDP劑量的增加而逐漸增大(P<0.05)，以5ug/mlDDP組凋亡率最大(11.38±0.42)％，2ug/mlDDP組與3ug/mlDDP組有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。XIAP蛋白熒光指數(shù)(FI)隨化療劑量的增加逐漸降低(P<0.05)。隨著細(xì)胞凋亡率增加的同時XIAP的蛋白表達(dá)熒光指數(shù)水平逐漸下調(diào)，細(xì)胞凋亡率的變

10、化與XIAP蛋白熒光指數(shù)(FI)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.984，P<0.01)。我們選用3ug/ml DDP用于后續(xù)實驗。 3、MTT法檢測Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ASODN前后聯(lián)合順鉑作用對細(xì)胞增殖抑制的影響結(jié)果顯示不同濃度的XIAP ASODN(100nmol/L-600nmol/L)轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞后均對細(xì)胞增殖有抑制作用，并呈時間和劑量的依賴性，各時段及各濃度的XIAPASODN與3ug/mlDDP聯(lián)合作用對細(xì)胞的生長抑制

11、率顯著高于單用XIAP ASODN組和單用DDP組，差異均有顯著性意義(P<<0.05)。 4、XIAP反義寡核苷酸對順鉑誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示ASODN+DDP組凋亡率與單純DDP組相比細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；而SCODN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率與空白對照組相比沒有顯著性差異(P>0.05)，SCODN轉(zhuǎn)染+DDP組與單純DDP組細(xì)胞凋亡率也沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 5、RT-

12、PCR檢測XIAP反義寡核苷酸聯(lián)合順鉑作用對Hep-2細(xì)胞中XIAP mRNA的影響結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為802bp大小的特異性條帶，ASODN組較空白對照組、脂質(zhì)體對照組、SCODN對照組相比，XIAP擴(kuò)增條帶的亮度明顯降低。說明200nmol/LASODN作用于Hep-2細(xì)胞36小時后，XIAP mRNA的表達(dá)下調(diào)，ASODN+DDP組XIAP mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，而對照組和SCODN組XIAP mRNA水平無明顯變化。

13、 6、XIAP反義寡核苷酸對順鉑作用前后Hep-2細(xì)胞XIAP蛋白表達(dá)的影響結(jié)果顯示ASODN治療組的XIAP蛋白熒光指數(shù)明顯低于空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組以及SCODN轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，ASODN轉(zhuǎn)染+DDP組比單純DDP組熒光指數(shù)明顯降低(P<0.01)，SCODN轉(zhuǎn)染+DDP組與單純DDP組XIAP蛋白熒光指數(shù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。Pearson相關(guān)分析顯示：在不同處理組與對照組中細(xì)胞凋亡率的變化與XIAP蛋白