木黃銅誘導人喉癌細胞系Hep-2凋亡及抑制其增殖的研究.pdf

1、目的:喉癌是全人類第11種常見的惡性腫瘤，主要來源喉部粘膜上皮組織。喉癌在病理組織學上，絕大部分為鱗狀上皮細胞。治療喉癌的傳統(tǒng)方法主要是手術，放療或輔助治療。雖然手術切除病灶是治療喉癌的直接手段，但術后要面對局部腫瘤高復發(fā)率的風險或是因發(fā)音和吞咽功能障礙所帶來的較差的生活質(zhì)量。尋求一種可以使腫瘤縮小，減小切除范圍，降低復發(fā)率及提高患者生活質(zhì)量和生存率的新化療輔助藥物顯得日益重要。細胞凋亡也稱細胞程序性死亡，其過程是由大量相關因子和信號通

2、路共同參與，并嚴格調(diào)控的，是確保機體穩(wěn)態(tài)，維持組織和器官形態(tài)正常必不可少的條件。異常的調(diào)亡途徑常常會引起人類各種疾病，其中包括腫瘤。逃脫細胞凋亡不僅是腫瘤的常見特征也是腫瘤對化療藥物形成抵抗的形成原因。因此，那些可以通過阻斷或抑制細胞增殖引起細胞凋亡的藥物極有可能成為抗腫瘤藥物。木黃酮(Genistein)，化學名為4、5、7-三羥基異黃酮，是從廣泛存在自然界的豆科植物中發(fā)現(xiàn)的一種具有天然生物活性的黃酮類化合物。攝入木黃酮后對機體除了產(chǎn)

3、生以抗腫瘤為主的重要生物效應以外，還具有抑制骨質(zhì)疏松形成、預防心血管疾病發(fā)生及減少絕經(jīng)后不良反應等多種衛(wèi)生保健作用。大量實驗證實木黃酮在體內(nèi)外對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用。它的主要抗腫瘤機制為:1.調(diào)控細胞周期:經(jīng)木黃酮處理后，大部分腫瘤細胞能夠出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，可能與木黃酮可以調(diào)節(jié)細胞周期蛋白(cyclin B)、CDKIs(p21WAF1)在腫瘤細胞中的表達量有關。2.誘導細胞凋亡:用各種標志性檢測細胞凋亡的技術方法，可

4、以觀察到經(jīng)木黃酮干預后的腫瘤細胞出現(xiàn)了細胞凋亡， caspase-3的激活， Bcl-2、Bcl-xL表達量下降及Bax高表達等為其主要分子機制。3.調(diào)節(jié)細胞侵襲與轉(zhuǎn)移:木黃酮可以從抑制FAK的磷酸化，選擇性抑制MMPs，抑制TGF-β信號途徑等多種途徑，影響細胞粘附、遷移及侵襲。4.作為植物性雌激素:因為有著與17-β-雌二醇相似的化學結(jié)構(gòu)，使其具有部分雌激素作用，可以與雌激素受體結(jié)合，近而影響性激素介導的腫瘤的生長（乳腺癌、前列腺癌

5、等）。5.其他:影響VEGF的表達，抗血管形成;清除自由基，減少或防止活性氧對細胞的損傷，實現(xiàn)抗氧化作用。本實驗旨在以人喉癌細胞系Hep-2為研究對象，通過倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、CCK-8試劑盒、流式細胞術等方法和技術觀察木黃酮對人類喉癌細胞系Hep-2抑制細胞周期和增殖及誘導細胞凋亡的作用，從而為木黃酮應用于臨床中喉部腫瘤的治療提供一些實驗室數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1、在體外適宜條件下培養(yǎng)人喉癌細胞系Hep-2，并給

6、予不同濃度的木黃酮進行干預。
　　2、通過CCK-8試劑盒檢測木黃酮對喉癌細胞增殖的抑制程度。
　　3、分別在倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察經(jīng)木黃酮干預后細胞在細胞形態(tài)學以及生長情況等方面的變化。
　　4、應用流式細胞術檢測木黃酮對細胞周期各時相分布的影響和誘導細胞凋亡的情況。
　　5、應用實時熒光定量PCR檢測木黃酮引起人喉癌細胞系Hep-2中Bcl-2 mRNA、Survivin mRNA表達量的改變。

7、r>　　6、統(tǒng)計學處理:用統(tǒng)計軟件SPSS13.0分析和統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)結(jié)果。正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差((x)+s)表示。比較兩樣本均數(shù)選擇t檢驗。用單因素方差分析進行多樣本均數(shù)間的比較，若有顯著性差異，接著用LSD法進行兩兩比較。所有比較結(jié)果，當P＜0.05時則可認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:倒置相差顯微鏡下觀察喉癌細胞形態(tài)學變化:空白對照組中的Hep-2細胞飽滿，細胞形態(tài)輪廓清晰，呈梭形、多邊形、上皮細胞樣，良好的貼壁生

8、長，在培養(yǎng)液中未見明顯懸浮細胞。給予木黃酮干預的細胞胞漿濃縮，邊緣不規(guī)則，可見部分細胞表面有出芽現(xiàn)象，一些溶解破碎細胞及脫落的懸浮細胞。CCK-8實驗結(jié)果證明木黃酮可以明顯抑制喉癌細胞的增殖，隨著藥物濃度的增加，其抑制率不斷上升，有顯著的劑量依賴關系。流式細胞儀檢測結(jié)果表明:木黃酮可以引起細胞G2期阻滯，當藥物濃度增加時會出現(xiàn)S期阻滯，并伴隨著G1期細胞比例的下降。喉癌細胞經(jīng)12μg/ml木黃酮干預24小時后，其G2期及S期的細胞累積量

9、明顯增多，分別與對照組相比較，其差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不僅如此，木黃酮還能誘導喉癌細胞出現(xiàn)凋亡，而且隨著藥物濃度增加和作用時間的累積，凋亡細胞數(shù)逐漸上升，呈明顯的時間和劑量依賴關系。相同作用時間，不同濃度木黃酮作用于喉癌細胞后所誘導的凋亡率差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），相同濃度的木黃酮分不同時間長度作用喉癌細胞后，其出現(xiàn)的凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。應用實時熒光定量PCR可以檢測到:Bcl-2 mRNA、

10、Survivin mRNA在經(jīng)過木黃酮處理后的喉癌細胞中表達量下降，分別與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、木黃酮能夠?qū)戆┘毎礖ep-2的增殖具有抑制作用，而且抑制作用呈劑量依賴效應。
　　2、木黃酮可以使喉癌細胞發(fā)生細胞周期阻滯，主要阻滯在G2期;隨著藥物濃度，處于S期的細胞百分比例也有明顯上升。阻滯細胞周期可能是木黃酮誘導喉癌細胞系Hep-2凋亡的一種作用機制。