蜂膠乙醇提取物誘導人喉癌Hep-2細胞凋亡及其對p56、Bcl-2表達影響的研究.pdf

1、目的:蜂膠是蜜蜂從植物的幼芽及樹干上采集的樹脂,并混入其上顎腺分泌物、蜂臘和少量花粉加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。據(jù)報道世界各地在蜂膠中共鑒定出300多種成分,其中很多單成分具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤以及提高免疫功能的作用。在民間用于治療各種疾病,如,心血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、牙齒疾病,皮膚病和癌癥,提高免疫力,治療消化道潰瘍、保護肝臟等。研究表明蜂膠對體外培養(yǎng)的多種癌細胞有殺傷作用,對小鼠移植的肝腫瘤、S180肉瘤、腹水瘤細

2、胞等體內(nèi)腫瘤有抑制作用。蜂膠又是一種天然的免疫強化劑,對腫瘤細胞有選擇性的殺傷效應,而對正常細胞無影響或傷害很小。
　　 此項研究的目的是為了探討蜂膠體外誘導人喉癌Hep-2細胞凋亡及對p53、Bcl-2表達的影響。
　　 方法:
　　 1.四甲基偶氮唑鹽比色分析法(MTT)測定蜂膠對Hep-2細胞存活率的影響當細胞在對數(shù)生長期,加入不同濃度的蜂膠,分別作用24、48、72h后,加入MTT,4 h后傾去上清液,加

3、入DMSO充分溶解形成的結(jié)晶,用酶標儀測OD值(570nm),并計算抑制率。
　　 2.流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞周期收集對照組和不同濃度蜂膠作用24 h后的細胞,以及80μg/ml蜂膠作用不同時間(24、48及72h)的細胞,上機進行細胞凋亡分析和細胞周期分析。
　　 3.透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)蜂膠作用于Hep-2細胞48h后,各組收獲1×107個細胞樣品,洗滌,2％戊二醛和1％四氧化鋨雙固定,常規(guī)包埋、聚合、切

4、片,醋酸雙氧鈾、鉛染液染色。透射電鏡下觀察,照相。
　　 4.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)p53和Bcl-2 mRNA在6孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)Hep-2細胞,80μg/ml蜂膠作用4、8、12、16、20h后提取RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析。
　　 5.Western blot測p53、Bcl-2蛋白表達在6孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)Hep-2細胞,80μg/ml蜂膠作用4、8、12、16、20h后,提

5、取蛋白,SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS—PAGE)分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)),分別加p53和Bcl-2單抗,再加入羊抗兔IgG-HRp,顯色反應。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法測得,蜂膠160μg/ml作用72h對細胞抑制率是76.4％,低濃度(20μg/ml)作用24h對細胞抑制率是10.4％,抑制率隨蜂膠劑量增大、作用時間延長而增大,存在劑量、時間依賴關系(p<0.05)。
　　 2.流式細胞技術檢測結(jié)

6、果顯示,不同劑量蜂膠作用24h后均出現(xiàn)不同程度的AP峰,低濃度(20μg/ml)作用24h后凋亡率為5.11％,160μg/ml24h后細胞凋亡百分率達34.92±1.72％,各濃度組與陰性對照組比較、各濃度組之間凋亡百分率差異有顯著性(P<0.05),具有濃度依賴關系。80μg/ml蜂膠作用24、48、72h,細胞凋亡率分別為27.25％、38.15％、45.44％,各時間組之間抑制率差異有顯著性(P<0.05),具有時間依賴關系。<

7、br>　　 3.透射電鏡可見,蜂膠處理后胞質(zhì)濃縮,核畸形,染色質(zhì)高度凝集,邊集,并有典型的凋亡細胞和凋亡小體。
　　 4.RT-PCR檢測結(jié)果顯示,Hep-2細胞株經(jīng)80μg/ml蜂膠處理后,p53/β2比值為1.9～2.0,p53mRNA在各個時間段無明顯變化(p>0.05),而Bcl-2mRNA在蜂膠作用后逐漸減少,Bcl/β2比值由4h的1.4逐漸減少到20h的0.9(p<0.05)。
　　 5.Westem b

8、lot檢測結(jié)果 Hep-2細胞株經(jīng)80μg/ml蜂膠處理后,4h開始其P53蛋白表達逐漸增多,p53/hsp70比值由4h的1.3逐漸增至2.3(p<0.05),而Bcl-2蛋白表達逐漸減少,Bcl-2/hsp70比值由4h的1.2逐漸減少為0.7((p<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.蜂膠乙醇提取物能夠體外抑制喉癌細胞hep-2的生長,誘導喉癌細胞凋亡,抑制率、凋亡率有時間、劑量依賴關系,對細胞周期有一定的影響,