RNA干擾原癌基因c-Met對(duì)鼻咽癌作用的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：
　　 目的：檢測(cè)原癌基因c-Met在鼻咽癌組織中的表達(dá)及臨床意義，探討其在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用。
　　 方法：采用免疫組織化學(xué)SP 法和RT-PCR分別檢測(cè)31例鼻咽癌及10例慢性鼻咽炎性組織中c-Met 蛋白及c-Met mRNA的表達(dá)水平，并聯(lián)系其臨床病理資料。
　　 結(jié)果：c-Met 蛋白在鼻咽癌活檢組織中的陽性表達(dá)率明顯高于鼻咽炎性組織，差異有極顯著性。C-Met的表達(dá)與鼻咽癌的臨床分期

2、、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；與年齡、性別、組織分型均無相關(guān)。C-Met mRNA在鼻咽癌活檢組織中的表達(dá)水平明顯高于鼻咽炎性組織，差異有顯著性。
　　 結(jié)論：鼻咽癌組織中c-Met 蛋白及mRNA 水平均存在高表達(dá)，c-Met的高表達(dá)與其侵襲和轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，c-Met 可作為鼻咽癌臨床治療及預(yù)后的參考指標(biāo)。
　　 第二部分：
　　 目的：設(shè)計(jì)以人c-Met基因?yàn)榘邢虻膕hRNA，構(gòu)建攜帶此shRNA的重組質(zhì)粒，檢測(cè)

3、其抑制c-Met表達(dá)的效應(yīng)，篩選RNA 干擾作用最強(qiáng)的shRNA 片段。
　　 方法：針對(duì)c-Met基因的mRNA 序列設(shè)計(jì)3個(gè)干擾靶點(diǎn)，分別構(gòu)建3個(gè)shRNA 質(zhì)粒表達(dá)載體和1個(gè)隨機(jī)序列質(zhì)粒表達(dá)載體，經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增，酶切、PCR、測(cè)序鑒定，用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE-2細(xì)胞中，采用real-time PCR和westernblot 檢測(cè)c-Met基因在mRNA和蛋白表達(dá)情況，比較轉(zhuǎn)染前后其表達(dá)差異，判斷各shRN

4、A的干擾效應(yīng)。
　　 結(jié)果：經(jīng)測(cè)序證實(shí)，成功構(gòu)建pGP-silencer-U6/Neo/GFP/c-Met 真核表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞后，c-Met基因的mRNA 水平及蛋白水平明顯下調(diào)，其中以2 號(hào)重組質(zhì)粒效應(yīng)最強(qiáng)，mRNA 水平下調(diào)90％，蛋白水平下調(diào)75％。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對(duì)c-Met基因的RNAi 重組質(zhì)粒，為下一步研究c-Met基因?qū)Ρ茄拾〤NE-2細(xì)胞生物學(xué)行為的功能奠定了基礎(chǔ).

5、>　　 第三部分：
　　 目的：探討c-Met shRNA 真核表達(dá)載體對(duì)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡作用的影響。
　　 方法：建立轉(zhuǎn)染pGP-silencer-U6/Neo/GFP/c-Met 真核表達(dá)質(zhì)粒和隨機(jī)序列對(duì)照質(zhì)粒的穩(wěn)定單克隆細(xì)胞，分別采用CCK-8、基質(zhì)膠粘附實(shí)驗(yàn)、體外遷移實(shí)驗(yàn)、transwell 體外侵襲實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞粘附率、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力、細(xì)胞侵襲能力及細(xì)

6、胞凋亡率的變化。
　　 結(jié)果：c-Met表達(dá)下調(diào)后，CNE-2細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞對(duì)基質(zhì)膠的粘附率明顯降低，CNE-2細(xì)胞的體外遷移能力、侵襲能力明顯降低，CNE-2細(xì)胞凋亡率增加。
　　 結(jié)論：原癌基因c-Met 明顯地促進(jìn)了鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株的體外增殖、粘附、遷移和侵襲能力，抑制了鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的凋亡。提示c-Met在鼻咽癌的惡性進(jìn)展中起重要作用，是一個(gè)潛在的鼻咽癌治療靶點(diǎn)。
　　 第四部分：

7、>　　 目的：探討c-Met shRNA 真核表達(dá)載體對(duì)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響。
　　 方法：建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，觀察c-Met shRNA 真核表達(dá)載體的抗瘤療效，分別在CNE-2細(xì)胞形成的移植瘤的體部和基底部多點(diǎn)微量注射c-Met shRNA 真核表達(dá)載體質(zhì)粒，注射等體積的隨機(jī)質(zhì)粒載體和生理鹽水作為對(duì)照組，記錄腫瘤體積的增長曲線，并在4周后處死裸鼠，取出移植瘤，用Western Blot 及TUN

8、EL分別檢測(cè)移植瘤中原癌基因c-Met 蛋白的表達(dá)水平和腫瘤細(xì)胞原位凋亡率。
　　 結(jié)果：36只裸鼠無一死亡，體重均勻增加，成瘤率100％。在注射組中，c-Met shRNA真核表達(dá)載體組的腫瘤體積的增長均比相應(yīng)的注射隨機(jī)質(zhì)粒載體和生理鹽水組要慢。取出的移植瘤中c-Met 蛋白的表達(dá)和原位TUNEL 檢測(cè)結(jié)果提示：移植瘤中相對(duì)于生理鹽水對(duì)照組和隨機(jī)質(zhì)粒對(duì)照組，c-Met shRNA 真核表達(dá)載組c-Met 蛋白表達(dá)明顯下降；移植