rAAV介導(dǎo)干擾素-α基因治療鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文rAAV介導(dǎo)干擾素α基因治療鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究姓名：李湘平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：丁彥青20070418中文摘要方法為對(duì)照，探討干擾素在鼻咽癌的治療作用及作用機(jī)制，為鼻咽癌生物治療提供有價(jià)值的理論依據(jù)。一、重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體的包裝與鑒定采用分子克隆的方法將IFN—a表達(dá)序列插入pAAV質(zhì)粒的BamHI及EcoRI酶切位點(diǎn)之間，將EGFP表達(dá)序列插入pAAV質(zhì)粒的XhoI及Ec

2、oRI酶切位點(diǎn)之間分別成功構(gòu)建pAAVIFNⅡ及pAAVEGFP；采用無(wú)輔助病毒的雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法，pAAVIFNa(或pAAVEGFP)及rAAV包裝輔助質(zhì)粒pDG共同轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞，包裝病毒；采用氯仿處理PEG／NaCL沉淀氯仿抽提3個(gè)步驟分離、濃縮和純化重組腺相關(guān)病毒(rAAV)。通過(guò)RealTimePCR定量檢測(cè)，確定包裝病毒滴度均介于1011vg／ml～1012vg／ml之間。通過(guò)不同滴度rAAVEGFP轉(zhuǎn)染C666

3、1細(xì)胞，其結(jié)果顯示48小時(shí)以5104vg／細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最高，達(dá)95％以上，純化后的rAAV仍保持較強(qiáng)的感染性。RTPCR及Western結(jié)果顯示IFN—n在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平表達(dá)，表明rAAVIFN—n載體的高效性。二、rAAVIFNa對(duì)EBV()鼻咽癌細(xì)胞株的作用研究IFNn蛋白抑制EBV()鼻咽癌細(xì)胞株C666—1細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)抑制劑量(IC50)實(shí)驗(yàn)；rAAVIFNa轉(zhuǎn)染C6661細(xì)胞的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTT)；rAAVIFN。ft轉(zhuǎn)染

4、C6661細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)；RTPCR鑒定rAAVIFN—Q轉(zhuǎn)染C6661細(xì)胞后IFNn表達(dá)及轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá)變化：高效液相芯片技術(shù)(Liquichip)檢測(cè)rAAvIFNa轉(zhuǎn)染C6661細(xì)胞后細(xì)胞上清中人IFN—a的含量。數(shù)據(jù)采用SPSSl00統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果顯示：采用MTT試驗(yàn)，當(dāng)IFN，a蛋白濃度達(dá)到l105IU／ml，C6661細(xì)胞增殖明顯受抑制(達(dá)50％)，即IC50；MTT試驗(yàn)顯示，rAAVIFN