rAAV介導干擾素-α基因治療鼻咽癌的實驗研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學博士學位論文rAAV介導干擾素α基因治療鼻咽癌的實驗研究姓名：李湘平申請學位級別：博士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：丁彥青20070418中文摘要方法為對照，探討干擾素在鼻咽癌的治療作用及作用機制，為鼻咽癌生物治療提供有價值的理論依據。一、重組腺相關病毒(rAAV)載體的包裝與鑒定采用分子克隆的方法將IFN—a表達序列插入pAAV質粒的BamHI及EcoRI酶切位點之間，將EGFP表達序列插入pAAV質粒的XhoI及Ec

2、oRI酶切位點之間分別成功構建pAAVIFNⅡ及pAAVEGFP；采用無輔助病毒的雙質粒共轉染方法，pAAVIFNa(或pAAVEGFP)及rAAV包裝輔助質粒pDG共同轉染HEK293FT細胞，包裝病毒；采用氯仿處理PEG／NaCL沉淀氯仿抽提3個步驟分離、濃縮和純化重組腺相關病毒(rAAV)。通過RealTimePCR定量檢測，確定包裝病毒滴度均介于1011vg／ml～1012vg／ml之間。通過不同滴度rAAVEGFP轉染C666

3、1細胞，其結果顯示48小時以5104vg／細胞轉染效率最高，達95％以上，純化后的rAAV仍保持較強的感染性。RTPCR及Western結果顯示IFN—n在轉錄及翻譯水平表達，表明rAAVIFN—n載體的高效性。二、rAAVIFNa對EBV()鼻咽癌細胞株的作用研究IFNn蛋白抑制EBV()鼻咽癌細胞株C666—1細胞生長的半數抑制劑量(IC50)實驗；rAAVIFNa轉染C6661細胞的細胞增殖實驗(MTT)；rAAVIFN。ft轉染

4、C6661細胞流式細胞檢測；細胞凋亡檢測；RTPCR鑒定rAAVIFN—Q轉染C6661細胞后IFNn表達及轉移相關基因表達變化：高效液相芯片技術(Liquichip)檢測rAAvIFNa轉染C6661細胞后細胞上清中人IFN—a的含量。數據采用SPSSl00統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理。結果顯示：采用MTT試驗，當IFN，a蛋白濃度達到l105IU／ml，C6661細胞增殖明顯受抑制(達50％)，即IC50；MTT試驗顯示，rAAVIFN