用RNA干擾方法探討原癌基因c-erbB-,2-在原始卵泡生長啟動中的作用.pdf

1、目的：用RNA干擾方法，在引發(fā)原癌基因c-erbB2表達沉默或抑制的情況下，觀察其在原始卵泡的生長啟動中的作用及其在介導原始卵泡啟動生長的重要因子--表皮生長因子(EGF)在此過程中的作用。 方法：原始卵泡的獲取與培養(yǎng)；針對原癌基因c-erbB2進行RNA小干擾片段(smallinterference RNA，siRNA)的構(gòu)建并用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染原始卵泡；用RT-PCR。法檢測原癌基因c-erbB2mRNA的表達：用wester

2、 blotting檢測其蛋白表達情況；通過Knock-Down of基因c-erbB2的表達后，觀察原始卵泡的啟動情況。 結(jié)果： 1.大鼠卵巢中有原癌基因c-erbB2mRNA表達，檢測RT-PER擴增產(chǎn)物序列(322bp)，并與GeneBank中的序列比較，結(jié)果一致。 2.卵巢轉(zhuǎn)染siRNA后，用RT-PCR，western blot檢測靶基因c-erbB2表達，發(fā)現(xiàn)c-erbB2mRNA水平明顯下調(diào)(P＜0.

3、05)。三對siRNA抑制率分別為49.6％、46.7％、82.6％。同時其蛋白表達也明顯下調(diào)(P＜0.01)。 3.選擇最佳抑制效果的那對siRNA,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)中的卵巢，觀察到：對照組8天后大部分原始卵泡發(fā)育為初級卵泡，而siRNA組初級卵泡和次級卵泡數(shù)明顯減少(P＜0.01)；EGF組與對照組相比，原始卵泡數(shù)減少，次級卵泡數(shù)明顯增多(P＜0.01)；EGF+siRNA組與對照組比較，無明顯差別(P＞0.05)。 結(jié)論：