原癌基因c-erbB-,2-在大鼠原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)中作用的初探.pdf

1、目的: 完善原始卵泡的體外培養(yǎng)技術(shù)；探索原癌基因c-erbB2在大鼠原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)變化及可能的作用。 方法: (1)選擇2日齡SD大鼠，建立Waymouth和DMEM兩種卵巢體外培養(yǎng)體系，用組織切片和HE染色法觀察原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)情況，用免疫組化和Western blot方法檢測(cè)卵泡活化生長(zhǎng)的重要標(biāo)志物--增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)情況，以判斷原始卵泡在兩種培養(yǎng)體系中的生長(zhǎng)狀態(tài)，挑選出適合原始卵泡生長(zhǎng)

2、發(fā)育的體外培養(yǎng)體系。 (2)用原位雜交、RT-PCR和免疫組化方法檢測(cè)c-erbB2mRNA和蛋白在原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)中及在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)作用下的表達(dá)情況。 (3)用Western blot方法同步測(cè)定p-ERK1/2蛋白在原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)中及在EGF作用下的表達(dá)情況，并分析與c-erbB2mRNA表達(dá)變化的相關(guān)關(guān)系。 結(jié)果: (1)經(jīng)組織形態(tài)學(xué)的比較、各級(jí)正常卵泡數(shù)量的計(jì)算及PCNA表達(dá)情況的分析

3、顯示，原始卵泡在Waymouth培養(yǎng)體系中存活和生長(zhǎng)情況優(yōu)于DMEM培養(yǎng)體系：并觀察到在Waymouth培養(yǎng)體系中加入50ng/ml EGF能進(jìn)一步促進(jìn)原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)。 (2)原位雜交結(jié)果顯示，c-erbB2mRNA在大鼠原始卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中均有表達(dá)，主要位于卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)，有隨卵泡生長(zhǎng)逐漸增加趨勢(shì)；半定量RT-PCR結(jié)果顯示，c-erbB2mRNA表達(dá)在2日齡大鼠卵巢培養(yǎng)8d后與培養(yǎng)0d(對(duì)照組)相比顯著增加(相對(duì)光密度值分別

4、為0.297±0.018和0.178±0.011，P＜0.05)，并在50ng/ml EGF作用下進(jìn)一步增強(qiáng)；免疫組化結(jié)果顯示，ErbB2蛋白在大鼠原始卵泡生長(zhǎng)過(guò)程中均有表達(dá)，主要表達(dá)于卵母細(xì)胞胞膜上，也有隨卵泡生長(zhǎng)逐漸表達(dá)增強(qiáng)的趨勢(shì)。 (3)Western blot結(jié)果顯示，磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(p-ERK1/2)也隨卵泡發(fā)育其含量不斷增加，在50ng/ml EGF作用下進(jìn)一步增強(qiáng)。經(jīng)Spearman相關(guān)分析表明，在

5、原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)過(guò)程中，p-ERK1/2含量的變化與c-erbB2 mRNA的表達(dá)變化呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(rs=0.900，P＜0.05)。 結(jié)論: (1)建立了新生大鼠卵巢體外培養(yǎng)體系。 (2)原始卵泡中有c-erbB2mRNA及蛋白的表達(dá)，且隨原始卵泡的啟動(dòng)生長(zhǎng)過(guò)程表達(dá)增強(qiáng)，EGF在促進(jìn)原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)的同時(shí)，也使c-erbB2mRNA及蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，表明原癌基因c-erbB2在原始卵泡啟動(dòng)生長(zhǎng)中起重要作用