蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)受體激酶2的作用及芍藥苷對(duì)其的影響.pdf

1、目的:
　　根據(jù)佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠的足爪腫脹、評(píng)分、關(guān)節(jié)滑膜及病理形態(tài)學(xué)等改變,觀察芍藥苷(paeoniflorin,Pae)對(duì)AA大鼠巨噬細(xì)胞分泌Il-1水平、T、B細(xì)胞增殖水平的影響;在整體、器官、細(xì)胞水平上明確Pae對(duì)AA大鼠的治療作用;以AA發(fā)病的靶細(xì)胞—成纖維滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)為突破口,觀察Pae對(duì)AA大鼠FLS的增殖

2、、cAMP水平、含有SH2結(jié)構(gòu)域的酪氨酸蛋白磷酸酶( Src homology2 domain-containing protein tyrosine phosphatase-2,SHP-2)、G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G-protein-coupled receptor kinases2,GRK2)表達(dá)的影響;分析Pae是否通過(guò)影響SHP-2在AA大鼠FLS中的表達(dá)情況而發(fā)揮效應(yīng)。明確SHP-2在FLS中調(diào)節(jié)GRK2的作用及Pae治療大鼠

3、AA的可能的分子機(jī)制。
　　方法:
　　大鼠左后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant,FCA)制備大鼠AA模型;以Pae(25、50、100 mg·kg-1)灌胃給藥(intragastric administration, ig)(d14-d24)。計(jì)數(shù)法測(cè)定多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù),稱重法測(cè)定脾臟指數(shù), ELISA法檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌IL-1水平,氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷摻入法測(cè)定T、B淋巴細(xì)

4、胞增殖反應(yīng),HE染色法光鏡觀察關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)變化等。組織塊法培養(yǎng)大鼠FLS, MTT法檢測(cè)FLS的增殖反應(yīng);放射性免疫法測(cè)定FLS cAMP水平;Western blot技術(shù)檢測(cè)FLS中GRK2、SHP-2的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.Pae對(duì)AA大鼠的治療作用
　　Pae(25、50、100 mg·kg-1)于造模后d14-d24灌胃給藥均不同程度明顯減輕AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)、繼發(fā)側(cè)腫脹度、升高的脾臟指數(shù)、升

5、高的巨噬細(xì)胞分泌IL-1水平、增強(qiáng)的T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及關(guān)節(jié)病理形態(tài)改變等方面都有不同程度的改善作用。光鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜組織中輕度的滑膜增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少;滑膜下有少量纖維增生、血管翳減輕;軟骨受損程度減輕,僅見(jiàn)少量炎細(xì)胞;骨髓腔中脂肪細(xì)胞明顯減少、骨骼細(xì)胞密集。充分顯示了Pae對(duì)AA大鼠具有治療作用。
　　2.SHP-2抑制劑NSC-87877對(duì)AA大鼠FLS增殖、胞內(nèi)cAMP水平、GRK2及SHP-2表達(dá)的影響

6、　　加入SHP-2抑制劑(NSC-87877)(10-5 mol·L-1)后,可顯著抑制AA大鼠FLS的過(guò)度增殖,升高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,降低AA大鼠FLS中GRK2、SHP-2的高表達(dá)水平;分離FLS胞漿、胞膜蛋白,應(yīng)用Western-blot方法,檢測(cè)顯示加入NSC-87877(10-5 mol·L-1)能顯著降低AA大鼠FLS細(xì)胞膜中GRK2蛋白的高表達(dá)水平,顯著升高AA大鼠FLS細(xì)胞漿中GRK2蛋白的低表達(dá)水平。
　　3.

7、Pae對(duì)AA大鼠FLS增殖、胞內(nèi)cAMP水平、GRK2及SHP-2表達(dá)的影響
　　Pae(10-5、10-6、10-7、10-8 mol·L-1)體外給藥后,可顯著抑制EP2受體激動(dòng)劑(Butaprost)刺激的AA大鼠FLS的過(guò)度增殖,升高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平,降低AA大鼠FLS中GRK2、SHP-2的高表達(dá)水平;分離FLS胞漿、胞膜蛋白,應(yīng)用Western-blot方法,檢測(cè)顯示Pae(10-5、10-6、10-7、10-8 m

8、ol·L-1)體外給藥能顯著降低AA大鼠FLS細(xì)胞膜中GRK2蛋白的高表達(dá)水平,顯著升高AA大鼠FLS細(xì)胞漿中GRK2蛋白的低表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　1、Pae對(duì)AA大鼠有一定的治療的作用,對(duì)其多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)、升高的脾臟指數(shù)、繼發(fā)側(cè)腫脹度、升高的巨噬細(xì)胞分泌IL-1水平、增強(qiáng)的T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及關(guān)節(jié)病理形態(tài)改變具有明顯的改善作用。
　　2、SHP-2抑制劑可下調(diào)AA大鼠滑膜細(xì)胞GRK2和SHP-2的高表達(dá);