蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香煙誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景和研究目的：吸煙是慢性阻塞性肺部疾病(COPD)的主要致病因素之一。香煙含有大量的氧化物質(zhì)，這些氧化物質(zhì)能激活蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2(proteintyrosinephosphataseShp2)活性。Shp2是一種由PTPNⅡ基因編碼的蛋白酪氨酸磷酸酶，含有2個(gè)SH結(jié)構(gòu)域，其作為細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及其他胞外刺激因素的下游信號(hào)分子廣泛地表達(dá)于機(jī)體各種組織和細(xì)胞中，參與細(xì)胞增殖、分化、死亡等諸多細(xì)胞生命活動(dòng)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)PT

2、PNⅡ突變將會(huì)導(dǎo)致青少年白血病、Noonan綜合癥，LEOPARD綜合癥等疾病。而Shp2與香煙煙霧所引起的肺損傷之間關(guān)系的研究無(wú)論是整體上還是離體上均未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。因此本課題主要研究Shp2在吸煙引起的肺炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用和作用機(jī)制。
　　 方法：離體實(shí)驗(yàn)用香煙提取物CSE刺激肺上皮細(xì)胞NCI-H292細(xì)胞，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞白介素-8(IL-8)基因表達(dá)和蛋白釋放上升；采用Shp2抑制劑PHPS1預(yù)處理或用siRNA干擾特異性

3、敲出Shp2，研究Shp2在CSE誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)和釋放中的調(diào)節(jié)作用。整體實(shí)驗(yàn)采用野生C57BL/6小鼠以及肺上皮細(xì)胞Shp2特異性基因敲除小鼠連續(xù)4天被動(dòng)吸煙誘導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)；計(jì)算肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)；肺組織勻漿后用Real-timeRCR方法測(cè)定肺組織中IL-8和Shp2基因表達(dá)，以及用Westernblotting方法測(cè)定蛋白的表達(dá)。采用免疫組化方法檢測(cè)人體氣道粘膜和小鼠肺組織

4、的Shp2表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)吸煙有道肺部炎癥：在離體實(shí)驗(yàn)中，香煙提取物(CSE)刺激肺上皮細(xì)胞NCI-H292，能引起細(xì)胞毒反應(yīng)包括促進(jìn)和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)能誘導(dǎo)一系列趨化因子和炎癥因子基因表達(dá)，其中IL-8基因表達(dá)最為顯著，CSE能濃度和時(shí)間依賴性促進(jìn)肺上皮細(xì)胞IL-8基因表達(dá)和蛋白分泌。整體動(dòng)物吸煙模型中，我們同樣發(fā)現(xiàn)吸煙能促進(jìn)肺部IL-8釋放和炎癥細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的聚集。
　　 (2)吸煙誘導(dǎo)

5、肺組織Shp2高表達(dá)和磷酸化：在離體試驗(yàn)中，CSE呈濃度依賴性誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞Shp2基因表達(dá)以及促進(jìn)Shp2磷酸化表達(dá)。人體樣本Shp2免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，與非吸煙者相比吸煙者肺部Shp2水平顯著升高；小鼠肺組織免疫組化實(shí)驗(yàn)也表明吸煙能誘導(dǎo)肺部Shp2水平的上升。
　　 (3)Shp2特異性抑制劑減輕吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥：離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Shp2特異性抑制劑PHPS1能有效抑制由CSE誘導(dǎo)的NCI-H292細(xì)胞IL-8基因表達(dá)和蛋

6、白分泌；整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，PHPS1能明顯降低吸煙小鼠肺部IL-8分泌和炎癥細(xì)胞聚集和浸潤(rùn)。這些結(jié)果表明，Shp2可能參與吸煙誘導(dǎo)的肺IL-8表達(dá)和炎癥反應(yīng)。(4)Shp2基因沉默或shp2敲除減輕吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥：離體實(shí)驗(yàn)表明，肺上皮細(xì)胞Shp2基因沉默后能顯著抑制CSE誘導(dǎo)的IL-8蛋白分泌；Shp2基因敲除小鼠研究Shp2在吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)中的作用發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，肺特異性Shp2敲除小鼠肺部IL-8含量以及炎癥細(xì)胞聚

7、集和浸潤(rùn)情況沒(méi)有明顯變化，但是經(jīng)過(guò)連續(xù)四天吸煙后，肺部Shp2敲除小鼠肺部IL-8含量以及炎癥細(xì)胞聚集和浸潤(rùn)明顯比正常吸煙小鼠減輕。這些結(jié)果更進(jìn)一步確立了Shp2在吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)中的作用。
　　 (5)Shp2通過(guò)MAPK信號(hào)通路影響吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥：離體實(shí)驗(yàn)中，CSE能濃度依賴性地誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞EGFR，Gab1和Shp2形成復(fù)合物。Erk1/2抑制劑U0126能顯著抑制CSE誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞IL-8釋放；CSE能濃

8、度和時(shí)間依賴性促進(jìn)磷酸化Erk1/2表達(dá)，PHPS1能顯著降低由CSE誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞Erk1/2磷酸化；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中PHPS1特異性抑制小鼠Shp2酶活性或者是小鼠肺上皮細(xì)胞特異性敲出后能有效抑制由吸煙誘導(dǎo)的Erk1/2磷酸化。這些結(jié)果表明PHPS1通過(guò)MAPK信號(hào)通路影響CSE誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞IL-8表達(dá)。
　　 結(jié)論：上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Shp2在吸煙誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵的作用。Shp2可能是治療吸煙引起的肺部炎癥疾病如