蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制劑篩選模型的構建及應用.pdf

1、蛋白質酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)是細胞信號轉導中的重要調節(jié)因子,與人類疾病密切相關。SHP-1是含有SH2結構域的具有高度保守序列的蛋白質酪氨酸磷酸酶的亞家族中的重要成員,研究表明,PTPs與糖尿病患者血糖控制以及糖尿病血管并發(fā)癥關系密切。尋找蛋白酪氨酸磷酸酶的高活性抑制劑對糖尿病和肥胖癥治療有著廣闊的應用前景。
　　本課題我們從人腦組織中獲取mRNA,通過RT-PCR擴

2、增出目標cDNA,構建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1-pEASY-E1重組質粒。將重組質粒轉化進E.coli TOP10感受態(tài)細胞中,篩選陽性克隆進行驗證,將測序正確的質粒轉化到E.coli Transetta感受態(tài)細胞中表達SHP-1,獲得具有生物活性的體外重組SHP-1蛋白。同時對表達條件進行了優(yōu)化,結果表明20℃,0.4 mmol/L IPTG對表達菌株進行誘導時,SHP-1在體外高效穩(wěn)定的表達。采用我們體外表達獲得的蛋白建立SHP-

3、1高通量篩選模型,對多種化合物用SHP-1抑制劑篩選模型進行篩選,尋找高活性的蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制劑,結果獲得活性化合物J11310。
　　實驗中以人肝癌細胞株HepG2細胞和大鼠骨骼肌成肌L6細胞為研究對象,選用胰島素30nM作為陽性對照對照,評價了J11310對細胞糖代謝的影響。結果表明,樣品J11310對HepG2細胞和L6細胞無毒性,可劑量依賴性的促進HepG2和L6細胞葡萄糖消耗,當濃度為1μg/mL時能顯著性促進細胞

4、葡萄糖消耗。提示樣品J11310的作用機制可能是通過促進肝臟和外周對葡萄糖的利用起到降葡萄糖作用。在HepG2細胞中加入胰島素,控制樣品的有無,以羅格列酮10-5M為陽性對照,比較細胞葡萄糖消耗量以評價樣品有無胰島素的協(xié)同作用。結果顯示,J11310在HepG2細胞中有較好的胰島素協(xié)同性,作用強于羅格列酮,以1μg/mL作用最強,隨著濃度降低,樣品對葡萄糖消耗的協(xié)同作用逐漸減弱,在10-4μg/mL,10-5μg/mL時無協(xié)同作用。用不

5、同濃度四氧嘧啶對RINm5F細胞進行損傷,樣品不同濃度的J11310均對損傷的胰島細胞RINm5F無保護作用。用細胞免疫熒光方法檢測細胞中PGC-1α、Pi-AMPK、Pi-IRS的表達量,結果顯示,樣品J11310與HepG2細胞作用后,磷酸化AMPK以及磷酸化IRs表達量增加,對PGC-1a的表達量無明顯影響。這提示,J11310可能通過激活AMPK活性發(fā)揮葡萄糖脂代謝調控作用,同時還提高了IRS磷酸化水平,繼而激活下游胰島信號的傳