酪氨酸磷酸酶SHP-1在腎臟缺血再灌注損傷中的作用及其免疫學(xué)機(jī)制.pdf

1、器官移植是最為有效的治療終末期臟器功能衰竭的方法，優(yōu)質(zhì)的供體器官是確保移植療效的先決條件。缺血再灌注（IR）損傷是發(fā)生在器官獲取和移植過程中的不可避免的病理生理過程，其存在可導(dǎo)致移植物無功能，功能延遲恢復(fù)，并增加移植物急、慢性排斥的發(fā)病率，降低移植物的中遠(yuǎn)期存活率。盡管已有多種研究報(bào)道聲稱可以減輕IR損傷，但真正能用于臨床治療的方法尚不多見。IR損傷仍然迫切需要有效的干預(yù)措施。IR損傷的病理生理過程涉及線粒體能量合成障礙、鈣超載、自由基

2、損傷和細(xì)胞凋亡，但更多的研究證明Toll樣受體（Toll like receptors, TLRs）所介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)在IR損傷中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。TLRs是表達(dá)在細(xì)胞表面的模式識別受體，除識別來自外源性病原微生物的病原相關(guān)分子模式以外，也能被內(nèi)源性的配體激活。這些內(nèi)源性的配體被稱為危險(xiǎn)信號相關(guān)分子模式，在機(jī)體組織細(xì)胞受到損傷之后被釋放，包括熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)、高遷移率族蛋白1(high m

3、obility group box-1protein, HMGB1)、雙糖鏈蛋白聚糖（Biglycan）等等。在再灌注早期，氧自由基及脂質(zhì)過氧化造成缺血組織的直接損傷，大量內(nèi)源性配體從這些損傷后的組織細(xì)胞被釋放，通過TLRs受體活化下游信號通路，產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子和趨化因子，介導(dǎo)IR后天然免疫反應(yīng)并發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　 SHP-1（又名SHPTP-1、SHP、HCP和PTP1C）是一種胞內(nèi)型的蛋白酪氨酸磷酸酶，主要表達(dá)于造血

4、來源的細(xì)胞和上皮細(xì)胞。SHP-1作為一種負(fù)相調(diào)節(jié)因子參與真核細(xì)胞內(nèi)的各種信號通路，負(fù)責(zé)控制信號級聯(lián)反應(yīng)的削減和終止。前期研究發(fā)現(xiàn)SHP-1可以抑制LPS、Poly:IC等外源性TLRs配體啟動(dòng)的活化信號，通過與TLRs信號通路中的白介素-1受體相關(guān)激酶1（interleukin-1receptorassociated kinase 1, IRAK1）相互作用，促進(jìn)I型干擾素的分泌，并通過抑制MAPK和NF-κB的活化，抑制下游促炎細(xì)胞因

5、子的產(chǎn)生。SHP-1的這種對于TLRs信號通路的負(fù)相調(diào)控在缺血再灌注損傷的病理生理背景下具有何種臨床意義？在復(fù)雜的體內(nèi)免疫反應(yīng)過程中，SHP-1參與眾多信號通路的調(diào)控，整體而言，其介導(dǎo)的負(fù)相調(diào)控將會(huì)產(chǎn)生何種結(jié)果？此外，據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS等活性物質(zhì)對于SHP-1的活性有調(diào)控，那么IR后劇烈的氧化應(yīng)激過程是否會(huì)影響SHP-1的表達(dá)和/或功能？也就是說，是否SHP-1本來就作為一個(gè)元素參與著IR后的炎癥反應(yīng)過程？
　　 鑒于

6、目前針對SHP-1在腎臟IR后病生反應(yīng)中調(diào)控作用的研究尚屬空白，亦無腎臟IR對SHP-1表達(dá)調(diào)控的相關(guān)報(bào)道，我們在本課題中首先研究了腎臟IR之后SHP-1的表達(dá)改變及其可能的調(diào)控機(jī)制，然后研究了SHP-1對腎臟IR后炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，在此基礎(chǔ)上，我們還構(gòu)建了可供體內(nèi)轉(zhuǎn)染過表達(dá)SHP-1的腺病毒，通過上調(diào)SHP-1表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證了SHP-1對腎臟IR損傷的保護(hù)作用。
　　 一、腎臟IR之后SHP-1的表達(dá)和活性改變及其調(diào)

7、控機(jī)制研究
　　 我們首先建立了體外原代培養(yǎng)的小鼠腎小管上皮細(xì)胞(TEC)的方法并進(jìn)行了鑒定；同時(shí)參照文獻(xiàn)所介紹的方法，建立了體外石蠟油模擬缺血再灌注損傷模型，該模型除適用于小鼠TEC以外，也適用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（M?）等貼壁細(xì)胞。通過這一模型，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過IR之后TEC和M?的SHP-1mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下降。隨后進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在小鼠雙側(cè)腎臟IR之后，腎組織SHP-1表達(dá)也同樣存在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的下調(diào)。我們進(jìn)一步

8、檢測了腎組織蛋白的SHP-1磷酸酶活性，結(jié)果顯示其活性隨著再灌注時(shí)間延長逐漸降低，并在再灌注24h后達(dá)到谷值。這一趨勢與SHP-1蛋白表達(dá)的改變是一致的。由此表明腎臟IR之后SHP-1的表達(dá)和活性確實(shí)是受到了抑制的，那么這種調(diào)控是由什么原因引起的呢？有研究曾指出ROS可以調(diào)控SHP-1的酶活性，而腎臟IR之后存在劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，伴隨著大量的ROS生成。是否IR后的氧化應(yīng)激參與了對SHP-1表達(dá)的調(diào)控呢？為了求證這一推論，我們使用H2

9、O2模擬氧化應(yīng)激刺激TEC和M?，發(fā)現(xiàn)H2O2呈劑量和時(shí)間依賴性地下調(diào)SHP-1的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的表達(dá)；經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)SHP-1的M?在受到H2O2刺激后同樣下調(diào)SHP-1的表達(dá)。為進(jìn)一步確證氧化應(yīng)激對SHP-1表達(dá)的調(diào)控作用，我們在腎臟缺血前1小時(shí)以及再灌注后4小時(shí)分別給小鼠腹腔注射MnTMPyP。MnTMPyP是一種確認(rèn)的超氧化物歧化酶激動(dòng)劑和抗氧化劑。通過這種效果已得到確認(rèn)的抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的方法，我們發(fā)現(xiàn)在生理鹽水處理組再灌注

10、后12小時(shí)SHP-1mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，但這種下調(diào)現(xiàn)象在抗氧化處理組就不存在了。從而進(jìn)一步證實(shí)了腎臟IR對于SHP-1的調(diào)控是通過氧化應(yīng)激作用產(chǎn)生的。
　　 本部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在腎臟IR后SHP-1的表達(dá)下調(diào)，其機(jī)制與氧化應(yīng)激刺激有關(guān)。
　　 二、SHP-1缺陷對腎臟IR損傷的影響及IR后TLRs信號通路的調(diào)控機(jī)制研究
　　 在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們采用了SHP-1部分缺陷的雜合子mev/+小鼠來進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，S

11、HP-1嚴(yán)重缺陷的純合子mev/mev小鼠的原代細(xì)胞來進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，研究SHP-1缺陷對腎臟IR損傷的影響。磷酸酶活性檢測結(jié)果證實(shí)雜合子mev/+小鼠腎組織中SHP-1磷酸酶活性顯著低于WT小鼠。生存分析結(jié)果顯示SHP-1缺陷的小鼠在腎臟IR后生存期顯著縮短，腎功能指標(biāo)（血肌酐和尿素氮）升高幅度也顯著高于同窩對照的野生型小鼠。腎組織病理切片顯示SHP-1缺陷小鼠在IR后腎小管細(xì)胞大量凋亡，壞死區(qū)域明顯，管腔堵塞嚴(yán)重，半定量病理評分顯著高

12、于野生型小鼠。
　　 隨后，我們研究了SHP-1缺陷之后的損傷加劇與炎癥反應(yīng)的關(guān)系，免疫組化結(jié)果顯示在SHP-1缺陷小鼠IR后的腎組織間質(zhì)中，大量巨噬細(xì)胞浸潤，程度明顯重于野生型小鼠。另外RT-PCR和髓過氧化物酶(MPO)的檢測也提示SHP-1缺陷小鼠的腎臟炎癥細(xì)胞浸潤程度顯著加重，這就為SHP-1缺陷小鼠偏重的病理損傷提供了解釋。
　　 文獻(xiàn)報(bào)道TLRs信號通路在腎臟IR過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，表達(dá)在腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞和造血來源

13、細(xì)胞表面的TLR2和TLR4通過識別IR早期直接損傷中受損細(xì)胞所釋放的內(nèi)源性配體，活化細(xì)胞，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)。促炎細(xì)胞因子，包括TNF-α、IL-1β和 IL-6等，都是TLRs信號通路的下游產(chǎn)物，不僅直接介導(dǎo)IR對細(xì)胞和組織的損傷，也可以通過自分泌和旁分泌的作用形成級聯(lián)反應(yīng)，加重IR造成的損傷。因此，我們進(jìn)一步研究了SHP-1缺陷對腎臟IR后炎癥因子的產(chǎn)生情況的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在再灌注后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，SHP-1缺

14、陷小鼠的腎組織炎癥因子mRNA和蛋白水平均較野生型小鼠顯著升高。使用來自SHP-1純合子缺陷小鼠的腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行體外IR之后的結(jié)果，以及來自SHP-1純合子缺陷小鼠的骨髓來源樹突狀細(xì)胞、脾臟細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞在經(jīng)受來自IR后腎組織勻漿刺激之后的結(jié)果都再次驗(yàn)證了這一結(jié)論。這些顯著增加的促炎細(xì)胞因子提示TLRs信號通路可能被異常地過度活化。為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們進(jìn)一步檢測了SHP-1缺陷小鼠腎臟IR前后TLR2、TLR4受體及其內(nèi)源性配體

15、Biglycan，HMGB1，HAS-1，HAS-2，HAS-3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SHP-1缺陷造成TLRs受體及其內(nèi)源性配體表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步的研究顯示，SHP-1缺陷還引起IR后腎組織的MAPK和NF-κB的活化增加，從而證實(shí)了TLRs信號通路過度活化是造成下游促炎細(xì)胞因子合成劇增的原因。
　　 由于IR損傷與細(xì)胞凋亡也密切相關(guān)，而又有研究報(bào)道聲稱SHP-1具有促凋亡的
　　 作用。那么SHP-1缺陷對腎臟IR之后的

16、細(xì)胞凋亡究竟是什么作用呢？我們的研究顯示SHP-1缺陷小鼠的腎組織凋亡水平與野生型小鼠并無明顯差異，提示可能另外存在某些促凋亡的機(jī)制抵消了SHP-1缺陷所產(chǎn)生的抗凋亡作用。鑒于TNF-α具有極強(qiáng)的促凋亡作用，而SHP-1缺陷之后TNF-α分泌大大增加，因此我們推測這可能是解釋SHP-1缺陷后凋亡現(xiàn)象并無改善的機(jī)制之一。
　　 本部分研究證實(shí)了SHP-1缺陷后腎臟IR損傷顯著加劇。這種加劇的損傷主要是炎癥反應(yīng)造成，而TLRs信號的

17、過度活化是造成炎癥反應(yīng)失控的主要原因。
　　 三、過表達(dá)SHP-1對腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　 在本部分研究中，我們首先構(gòu)建了可轉(zhuǎn)染小鼠活體的攜帶SHP-1質(zhì)粒的腺病毒，通過轉(zhuǎn)染，可以在小鼠腎組織和肝組織中短期內(nèi)穩(wěn)定高表達(dá)SHP-1。同時(shí)，經(jīng)磷酸酶活性檢測發(fā)現(xiàn)腺病毒轉(zhuǎn)染后小鼠腎組織的SHP-1酶活性顯著升高。我們使用該腺病毒轉(zhuǎn)染野生型小鼠和SHP-1缺陷小鼠，并在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)施行雙腎IR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SHP-

18、1可以減輕野生型小鼠IR后的腎損傷，而且在SHP-1部分缺陷的小鼠轉(zhuǎn)染過表達(dá)SHP-1可以逆轉(zhuǎn)由SHP-1缺陷所導(dǎo)致的IR后損傷加劇。進(jìn)一步研究顯示過表達(dá)SHP-1可以顯著抑制IR后腎組織內(nèi)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，由此從另一個(gè)方面證實(shí)了SHP-1對IR后炎癥反應(yīng)的負(fù)相調(diào)控作用。
　　 結(jié)合上述三部分的研究，我們得出結(jié)論，SHP-1對腎臟IR后的炎癥反應(yīng)過程呈負(fù)相調(diào)控作用，這種調(diào)控主要是通過抑制TLRs信號通路的活化，尤其是抑制TLR