睪丸支持細胞內的蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2調控精子的發(fā)生.pdf

1、支持細胞(sertoli cell)為各級生精細胞提供營養(yǎng)、支持、保護作用，分泌一些對精子發(fā)生有重要作用的成分，參與FSH、睪酮對生殖細胞的的調節(jié)作用。
　　Shp2是一種細胞質中的蛋白酪氨酸磷酸酶，彌散性表達于全身各器官，調控多種生長因子的信號，調節(jié)細胞增殖和分化、參與免疫反應、調控代謝。研究支持細胞當中的Shp2對精子發(fā)生的調控具有理論意義和實用價值。雖然在努男綜合癥(noonan)中涉及過Shp2與雄性生殖的關系，以及大鼠睪

2、丸支持細胞中Shp2介導肝細胞生長因子(HGF)的Ras-MAPK信號通路，過表達Shp2破壞血睪屏障marker(Zo-1，N-cadherin，β-cantenin，F(xiàn)-actin)的表達分布，且在小鼠整個睪丸或者在生殖細胞內敲除Shp2都能導致雄性不育，但Shp2在睪丸支持細胞內的作用與功能還未完全探討。
　　利用兩種模型Shp2flox/floxpAMH-cre、Shp2floxp/floxpinhibinα-cre，特異

3、性的在睪丸支持細胞、支持細胞與間質細胞當中去除Shp2。Shp2去除后，2周小鼠睪丸明顯減小，發(fā)育受阻，成年雄鼠100％不育。HE染色表明，3周開始睪丸出現(xiàn)空泡化，并可見睪丸結構破壞、精子發(fā)生受阻;8周附睪中不見成熟精子。雖然直到4周，TUNEL法檢測到睪丸切片內凋亡細胞數(shù)增加，但支持細胞marker-WT1免疫熒光染色表明，支持細胞數(shù)量一直沒有減少，到成年后，有部分曲細精管中只剩下支持細胞，沒有生殖細胞。
　　未分化的精原細胞m

4、arker-PLZF、精母細胞marker-S TRA8、減數(shù)分裂的marker-S CP3免疫熒光染色表明，2周精原干細胞和各級生精細胞的數(shù)量明顯減少了。然而在1周，精原干細胞數(shù)目沒有受影響;減數(shù)分裂啟動marker-STRA8和減數(shù)分裂中的marker-SCP3的陽性細胞數(shù)卻增加了，這表明精原干細胞分化增強了。進一步，精原細胞自我更新的marker-PH3與PLZF雙染，及KIT的單染實驗表明:Shp2在支持細胞去除后，對精原干細胞

5、的自我更新影響甚微，但在早期引起精原干細胞的過度分化。在探討分子機制上，Shp2在支持細胞去除后，引起支持細胞旁分泌蛋白SCF，BMP4（調節(jié)精原干細胞分化的因子）的表達量升高，而調節(jié)精原干細胞增殖的因子GDNF表達量不變;采用基因表達譜芯片分析，許多關于精原干細胞增殖與分化的基因表達產(chǎn)生了變化，如:LIN28a，Epcam，Etv5等。這些結果表明在支持細胞Shp2的去除打破了精原干細胞增殖與分化平衡，引起早期精原干細胞的過度分化。<

6、br>　　免疫組化與免疫熒光染色表明，與對照相比，支持細胞敲除組中的血睪屏障marker----緊密連接蛋白Claudin11、間隙連接蛋白Cx43，2周開始分布有明顯區(qū)別，表達量升高;緊密連接蛋白JAM-A在睪丸切片上連接消失，僅在支持細胞核內有表達，在組織中表達量顯著降低。組織免疫熒光染色表明，緊密連接蛋白Zo-1分布沒有明顯區(qū)別，表達量不變，而在4周黏附連接蛋白β-catenin表達量減少。在探討分子機制上，Shp2在支持細胞去除

7、后，血睪屏障調節(jié)蛋白TPA的表達量升高，而它的同類UPA的表達量不變。采用基因表達譜芯片分析，很多有關血睪屏障的基因的表達量發(fā)生變化，這些基因包括血睪屏障的某些marker（Claudin1，5，8，10，15下降，Cx43上升，TES下降）及調節(jié)蛋白(Icam1，Mmp2，Mmp17下降)。這些結果表明Shp2是血睪屏障的重要調控蛋白。TER實驗表明，在敲除Shp2支持細胞內恢復Shp2的表達，能逆轉支持細胞間的緊密連接程度;在正常支

8、持細胞內過表達Shp2，緊密連接程度減弱。這個結果表明支持細胞內合適的Shp2活性對血睪屏障的組裝是必須的。我們進一步探討了這個體系的機制，在支持細胞內敲除Shp2能抑制P-ERK的活性，而增加P-AKT的活性，轉染過表達Shp2的突變體(Q79P)能恢復P-ERK的活性，又能抑制P-AKT的表達（不論在對照還是在敲除細胞內）。
　　在信號通路機制探討方面，在支持細胞內Shp2的缺失能抑制FSH和睪酮刺激的P-ERK的活性，而使卵

9、泡刺激素(FSH)和睪酮(testosterone)刺激的P-AKT的活性進一步的升高;在支持細胞內Shp2的缺失能抑制FSH刺激ABP的升高，而使睪酮刺激的AR進一步的升高。Western blot分析了2周睪丸組織內FSH和睪酮target gene的表達，發(fā)現(xiàn)SCSKO組中Pem，ABP，PDGF-A，E-FABP的表達量下降;SCF，AR，DMRT1的表達量上升;AMH，F(xiàn)SHR，GDNF，WT1，Dhh，TRF，β-caten

10、in,N-cadherin的表達量沒有改變。
　　在TM4細胞中，Shp2的特異性抑制劑PHPS1抑制FSH引起P-ERK、P-AKT的上升，說明Shp2可通過支持細胞的FSH的MAPK，AKT信號通路來調節(jié)下游基因的表達。Shp2的特異性抑制劑PHPS1能抑制睪酮(T)引起TM4細胞P-ERK的上升，說明Shp2可參與支持細胞的睪酮(T)的MAPK信號通路，來調節(jié)下游基因的表達。此外，PHPS1能抑制FSH引起的TM4細胞功能性