G蛋白偶聯(lián)受體激酶在大鼠肝星狀細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及芍藥苷對(duì)其的影響.pdf

1、肝纖維化是由于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成大于降解導(dǎo)致過(guò)度沉積，是纖維增生與纖維分解不平衡而引起的病理過(guò)程。芍藥苷 (paeoniflorin，Pae)是白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）中的主要有效成分，本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，TGP具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗肝損傷和肝纖維化等作用。G蛋白偶聯(lián)受體激酶（G-protein-coupled receptors

2、 kinases，GRKs）是一簇與G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）快速脫敏相關(guān)的激酶，在調(diào)節(jié)GPCRs信號(hào)中起到至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)在以往研究基礎(chǔ)上，采用豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化模型，首先從整體水平考察了免疫性肝纖維化過(guò)程中大鼠肝臟與肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）中G蛋白偶聯(lián)受體激酶2（G-protein-coupled receptors ki

3、nase 2，GRK2）表達(dá)水平的變化；體外選用HSC-T6細(xì)胞株，從細(xì)胞和分子水平探討GRK2在HSC表達(dá)的變化，以進(jìn)一步探討其調(diào)節(jié)HSC G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及抑制HSC異常增殖的作用機(jī)制，并觀察Pae對(duì)HSC GRK2表達(dá)及轉(zhuǎn)膜的影響，
　　 目的：采用豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化模型，從病理形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)等方面，觀察免疫性肝纖維化大鼠肝臟及HSC中GRK2與G蛋白偶聯(lián)受體激酶3（G-protein-coupled

4、 receptors kinase 3，GRK3）的表達(dá)情況；以肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞HSC為突破口，觀察Pae對(duì)rhPDGF-BB刺激HSC-T6增殖的影響以及GRK2在HSC-T6增殖中的作用；探討G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在rhPDGF-BB刺激HSC-T6增殖中的作用和G蛋白表達(dá)的改變，部分闡明GRK2在HSC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)節(jié)作用及Pae抑制HSC增殖的分子機(jī)制。
　　 方法：Wistar大鼠腹腔注射豬血清建立免疫性肝纖

5、維化模型，設(shè)立正常對(duì)照組（0周）、模型組（3、6、9、12、16周），采用HE染色和Masson染色對(duì)肝臟組織作病理檢查；免疫組織化學(xué)染色法、蛋白免疫印跡法檢測(cè)肝臟中GRK2與GRK3表達(dá)水平的變化。原位灌流分離肝纖維化大鼠HSC，Western blot法檢測(cè)HSC中GRK2表達(dá)水平的變化。體外以HSC-T6為模型，設(shè)立正常對(duì)照組、rhPDGF-BB（50μg·L-1）刺激組、GRK2抑制劑（62.5～1000μmol·L-1）組、P

6、ae（10-4～10-6mol·L-1）組，采用MTT法檢測(cè)HSC增殖情況；3H-TdR法檢測(cè)HSC增殖情況；另外，設(shè)立正常對(duì)照組、rhPDGF-BB（50μg·L-1）刺激組、GRK2抑制劑（250μmol·L-1）組、Pae（10-5mol·L-1）組，采用放射性免疫法測(cè)定HSC-T6 cAMP水平；采用Western blot法檢測(cè)HSC-T6中GRK2、Gαi-1、Gαi-2、Gαs蛋白的表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：<

7、br>　　 1.免疫性肝纖維化大鼠肝臟中GRK2與GRK3的表達(dá)情況
　　 Wistar大鼠腹腔注射豬血清在16周時(shí)可以成功建立免疫性肝纖維化模型，在光鏡下可見(jiàn)中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)締組織變厚，增生的膠原纖維從匯管區(qū)延伸至小葉間，并向鄰近的肝小葉伸出纖維索，形成粗大的纖維間隔，并將增生的肝細(xì)胞團(tuán)包繞分隔成大小不等的假小葉。免疫組織化學(xué)染色與Western-blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)免疫性肝纖維化大鼠肝臟中GRK2與GRK3的表達(dá)較正常組明

8、顯降低，并且伴隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量有下降趨勢(shì)。
　　 2.GRK2在免疫性肝纖維化大鼠HSC中的表達(dá)
　　 在造模第3，6，9，12，16周原位灌流法分離、培養(yǎng)大鼠HSC，Western-blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，免疫性肝纖維化大鼠HSC中GRK2的表達(dá)較正常組明顯降低，并且伴隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量有下降趨勢(shì)。
　　 3.GRK2抑制劑與Pae對(duì)rhPDGF-BB刺激HSC-T6增殖的影響
　　 體外建立

9、rhPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6增殖模型，結(jié)果表明Pae在10-4～10-6mol·L-1濃度范圍內(nèi)明顯抑制HSC-T6增殖。當(dāng)加入GRK2抑制劑（5-甲基[2-(5-硝基-2-呋喃基)乙烯基]-2-糠酸酯，C12H9NO6）后，GRK2抑制劑（62.5～1000μmol·L-1）可以明顯抑制HSC-T6增殖。
　　 4.rhPDGF-BB刺激下HSC-T6 G蛋白-AC-cAMP通路的改變
　　 分離HSC-T6胞

10、漿、胞膜蛋白，應(yīng)用Western-blot方法，檢測(cè)rhPDGF-BB（50μg·L-1）刺激HSC-T6中G蛋白-AC-cAMP通路的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rhPDGF-BB可明顯促進(jìn)HSC-T6胞漿蛋白中GRK2的表達(dá)升高，同時(shí)降低Gαi-1和 Gαi-2的表達(dá)，但對(duì)Gαs的表達(dá)無(wú)明顯影響。而在HSC-T6胞膜蛋白中，rhPDGF-BB可明顯降低GRK2的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Gαi-1和 Gαi-2的表達(dá)升高。但對(duì)Gαs的表達(dá)無(wú)明顯影響。同時(shí)r

11、hPDGF-BB可以降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，促進(jìn)HSC-T6增殖。
　　 5.rhPDGF-BB刺激的HSC-T6 G蛋白-AC-cAMP信號(hào)通路與GRK2的關(guān)系及Pae 的作用
　　 在rhPDGF-BB刺激的HSC-T6中加入GRK2抑制劑（終濃度250μmol·L-1）后，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HSC-T6胞漿蛋白中GRK2表達(dá)降低，Gαi-1和 Gαi-2表達(dá)升高，而在胞膜蛋白中GRK2表達(dá)升高，Gα

12、i-1和 Gαi-2表達(dá)降低，同時(shí)Gαs的表達(dá)均無(wú)明顯改變。此外，GRK2抑制劑可以明顯提高由rhPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6 cAMP水平降低，抑制細(xì)胞增殖。而在HSC-T6中加入GRK2抑制劑（終濃度250μmol·L-1）與Pae（10-5mol·L-1）共培養(yǎng)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSC-T6胞漿蛋白中Pae可升高GRK2抑制劑誘導(dǎo)的GRK2表達(dá)減少，同時(shí)促進(jìn)了Gαi-1和 Gαi-2的表達(dá)的下降，而在胞膜蛋白中Pae可降低GRK2

13、抑制劑誘導(dǎo)的GRK2表達(dá)升高，同時(shí)促進(jìn)了Gαi-1和 Gαi-2的表達(dá)的增加，而Gαs的表達(dá)均無(wú)明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 1.豬血清誘導(dǎo)的免疫性肝纖維化大鼠肝臟組織和HSC中GRK2表達(dá)水平隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，提示GRK2可能是導(dǎo)致免疫性肝纖維化大鼠HSC異常增殖的重要分子。
　　 2.rhPDGF-BB可以明顯促進(jìn)HSC-T6胞漿蛋白中GRK2的表達(dá)，降低Gαi-1和 Gαi-2的表達(dá)，而在胞膜蛋

14、白中，rhPDGF-BB降低GRK2的表達(dá)，促進(jìn)Gαi-1和 Gαi-2的表達(dá)。同時(shí)rhPDGF-BB可以降低細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，促進(jìn)HSC-T6增殖。提示rhPDGF-BB可能改變HSC-T6胞漿胞膜上GRK2蛋白的分布，使HSC-T6 Gαi蛋白偶聯(lián)的信號(hào)通路激活，從而刺激了HSC-T6過(guò)度增殖。
　　 3.GRK2抑制劑可明顯抑制rhPDGF-BB誘導(dǎo)的HSC-T6胞漿蛋白中GRK2表達(dá)增加，促進(jìn)Gαi-1和 Gαi-2的