節(jié)點(diǎn)干預(yù)對(duì)無(wú)尺度細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的影響.pdf

1、目的：建立細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的方法，對(duì)細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)屬性獲得初步認(rèn)識(shí)，并在此基礎(chǔ)上根據(jù)實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)仿真技術(shù)分析不同類(lèi)型的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的功能地位，進(jìn)而認(rèn)識(shí)細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)對(duì)意外差錯(cuò)的承受能力，也為進(jìn)一步的深入研究提供指導(dǎo)。 方法：①細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析：根據(jù)已知的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之間的生化作用機(jī)制，進(jìn)行復(fù)雜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建。構(gòu)建主要包括以下三個(gè)步驟：確定在輸入刺激條件下能夠產(chǎn)生輸出效應(yīng)(行

2、使一定生理功能)的線(xiàn)性途徑；分析途徑之間發(fā)生相互作用的節(jié)點(diǎn)間的連接關(guān)系，確定不同節(jié)點(diǎn)的連接度；功能模塊的組織及其相互作用。根據(jù)構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)模型，從節(jié)點(diǎn)的連接度、節(jié)點(diǎn)的組織特征、信號(hào)交流和隨機(jī)性節(jié)點(diǎn)去除對(duì)網(wǎng)絡(luò)的影響等幾個(gè)不同的層次分析其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)屬性。②計(jì)算機(jī)仿真分析：采用自主開(kāi)發(fā)的計(jì)算機(jī)仿真軟件SIMTRAN2.0對(duì)上述細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的不同類(lèi)型的節(jié)點(diǎn)分子干擾所致的動(dòng)力學(xué)改變進(jìn)行仿真分析，仿真時(shí)間為120min，步長(zhǎng)為0.2min。通過(guò)改變相

3、應(yīng)反應(yīng)方程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)來(lái)模擬節(jié)點(diǎn)遭受的激活性或抑制性攻擊。目標(biāo)節(jié)點(diǎn)包括高連接度和低連接度兩大類(lèi)節(jié)點(diǎn)，模擬攻擊范圍包括單個(gè)節(jié)點(diǎn)遭受攻擊和多個(gè)節(jié)點(diǎn)同時(shí)遭受攻擊，攻擊性質(zhì)分為激活性和抑制性?xún)煞N。③節(jié)點(diǎn)抑制對(duì)小鼠神經(jīng)元信號(hào)網(wǎng)絡(luò)影響分析：小鼠神經(jīng)元原代培養(yǎng)7d后，進(jìn)行干預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)共分四組，對(duì)照組不加抑制劑，實(shí)驗(yàn)一組加入特異性Ras抑制劑(ManumycinA，M-1025)，實(shí)驗(yàn)二組加入特異性JAK抑制劑(420099)，實(shí)驗(yàn)三組加入特異性PD

4、E抑制劑(RO20-1724)，置于CO2培養(yǎng)箱中(5％CO2、、37℃)孵育過(guò)夜。抑制劑作用后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均給予EGF(20ng/μl)刺激，分別作用0min、10min、20min、60min、120min，用液氮終止EGF刺激作用。裂解細(xì)胞，收集蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250法蛋白定量，SDS-PAGE分離蛋白后半干式電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。采用Phospho-AKT單克隆抗體和Phospo-MEK1/2單克隆抗體結(jié)合持久性化學(xué)發(fā)光檢

5、測(cè)技術(shù)確定Phospho-AKT、Phospo-MEK1/2的相對(duì)強(qiáng)度。 結(jié)果：①通過(guò)構(gòu)建得到了一定尺度的復(fù)雜性細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)模型，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的連接度呈高度的不均一性，其中少數(shù)節(jié)點(diǎn)與其它眾多節(jié)點(diǎn)發(fā)生連接，而大多數(shù)節(jié)點(diǎn)只與其它較少節(jié)點(diǎn)發(fā)生連接。②計(jì)算機(jī)模擬的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)表明：Ras的持續(xù)性激活導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)輸出改變的強(qiáng)度和范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于一過(guò)性過(guò)度激活，網(wǎng)絡(luò)中重要節(jié)點(diǎn)(Ras、PI3K、PKA)的干擾效應(yīng)明顯超過(guò)普通節(jié)點(diǎn)(PDE、PAK、PLA

6、2)的干擾效應(yīng)。③多個(gè)節(jié)點(diǎn)聯(lián)合干擾所至信號(hào)網(wǎng)絡(luò)動(dòng)力學(xué)的改變是極其復(fù)雜的。④Western印跡結(jié)果表明Ras節(jié)點(diǎn)的抑制導(dǎo)致MEK1/2和AKT磷酸化水平明顯改變，而PDE或JAK節(jié)點(diǎn)分別抑制后MEK1/2和AKT磷酸化水平無(wú)明顯改變。根據(jù)相對(duì)強(qiáng)度曲線(xiàn)可以清晰看到，Ras節(jié)點(diǎn)阻斷后MEK1/2和AKT磷酸化水平分別由62.80％和46.13％降為8.86％和15.32％，而PDE或JAK節(jié)點(diǎn)分別抑制后MEK1/2和AKT磷酸化水平無(wú)明顯改變

7、。 結(jié)論：①細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)具有無(wú)尺度屬性，其重要節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)的組織、行使功能中起著重要作用。細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)對(duì)一定程度內(nèi)的隨機(jī)性節(jié)點(diǎn)意外差錯(cuò)具有驚人的承受能力。②細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)行為具有明顯的非線(xiàn)性。③重要節(jié)點(diǎn)與普通節(jié)點(diǎn)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致了其網(wǎng)絡(luò)功能的差異，重要節(jié)點(diǎn)通過(guò)直接或間接作用對(duì)眾多節(jié)點(diǎn)起著支配作用，而普通節(jié)點(diǎn)則僅僅與少數(shù)節(jié)點(diǎn)相關(guān)聯(lián)。重要節(jié)點(diǎn)的差錯(cuò)在信號(hào)網(wǎng)絡(luò)紊亂中具有重要地位，而普通節(jié)點(diǎn)的差錯(cuò)對(duì)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的影響較小。④網(wǎng)絡(luò)中廣