genistein對沙眼衣原體感染細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響

1、微生物學(xué)雜志 2 0 0 4年 9月 第 2 4卷 第 5期 J OU RNA LOFMI C R OB I O L OG Y S e p t ．2 0 0 4V o 1 ． 2 4N o ． 55· 研 究報 告 ·g e n i s t e i n對 沙眼衣原體 感染細胞信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)的影 響 張 小清 ， 余 平( 1 ． 湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)課部 生物化學(xué)教研室 。 湖南 郴 州 4 2 3 0 0 0 ； 2

2、． 中南 大學(xué) 免疫學(xué)教研室 。 湖南 長抄 4 1 0 0 7 8 )摘 要 研究酪氨 酸激 酶抑 制劑 g e n i s t e i n 對 I F N _ 7 誘 導(dǎo)沙眼 衣原體 感染 細胞 內(nèi)信 號 轉(zhuǎn)導(dǎo) 的影 響。 以 I F N _ 7作 用于沙眼衣原體 ( K 血清型) 感染 的 Mc C o y 細胞 ， 用 g e a i s t e i n阻斷 I F N - 7 對沙眼衣原體感染細胞 的作 用。用臺盼藍染 色法檢

3、測 沙眼衣原體感染細胞 存活率。用免 疫印跡 法檢測 蛋 白酪氨 酸激 酶磷 酸化及 J A K1 ／ S T AT 1活化 的改變。結(jié)果顯示 ： g e n i s t e i n可拮抗 I F N． 7降低 沙眼 衣原體 感染 細胞 存 活率 的作 用， 且 具有 劑量依 賴 效 應(yīng)。g e n i s t d n可押 帝 】 I F N - 7 誘導(dǎo) 的沙眼衣原體感 染細胞 蛋白酪氨酸激酶磷 酸化及 J A K 1 ／ S T A

4、 T I活化 ， 此作 用且 與 g e n i s t e i n 作 用 的 劑 量 有 關(guān) 。關(guān)鍵詞 蛋 白酪氨酸激酶 ； 抑制荊 ； 沙眼衣原體 ； I F N． 7 ； 信 號轉(zhuǎn)導(dǎo) 中圖分 類號 R 3 7 4． 1文獻標識碼 A文章編 號 1 0 0 5 —7 0 2 1 ( 2 0 0 4 ) 0 5 —0 0 0 5 —0 3沙 眼衣 原 體 ( C h l a m y d i at r a c h o m a t i

5、s ， C t ) 是 一 種 專性真 核 細 胞 內(nèi) 寄 生 的 原 核微 生 物 。I F N 一 丫可激 活感 染 的 宿 主細 胞 ， 抑制 包 括 在 內(nèi)的多種 微生 物在 細胞 內(nèi)的生 長 L 1 ． 2J 。I F N 一 7 對 感 染細胞的作用有細胞特異性 ， 在上 皮細胞中其抗 C ￡ 的 作 用 具 時 間 和 濃 度 效 應(yīng) L 3J 。 I F N 一 7通 過 I F N 一 丫受體作用于宿主細胞 ， 誘

6、導(dǎo)細胞內(nèi)吲哚胺一2 ， 3雙加氧酶、 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶以及主要 組織相容性復(fù) 合體分子 的表達 ， 也可下調(diào)衣原體 主 要外膜蛋 白的表 達L 4J 。I F N 一 丫 對 感染 細胞的上述 作 用 與 J A K ． s T A T 信 號通 路活 化有 關(guān)L 5J 。但在 感染的細胞 中， 此信號途徑活化特點并不 十分明了。為此 ， 我們對 I F N ． 丫誘 導(dǎo)感染 的Mc C o y 細 胞 中 酪 氨 酸 激 酶 磷

7、 酸 化 及 信 號 成 分 J A K 1 ， s T A T 1 的 活 化 是 否 受 酪 氨 酸 激 酶 特 異 性 抑制劑 g e n i s t e i n ( 4， 5 ， 7 ． 三羥異黃酮) 的影響進行 了研 究 ?，F(xiàn) 報告 如下 。1材料 與方法1 ． 1 材料 R PI 一 1 6 4 0 ( 美國 G I B C O公 司產(chǎn)品) ， 小牛血 清( 特 級 ) ( 杭 州 四季 青 產(chǎn) 品) 、 放 線 菌 酮 (

8、 美 國S I G MA公 司產(chǎn) 品) ， 重 組 鼠 I F N 一 丫 ( 英 國 P e p r o ．T e c hE CL t d 產(chǎn)品) ， 抗 S T A T 1 多克隆抗體( R &D公司產(chǎn) 品) ， 抗 J A K1多克 隆抗體 ( R & D 公 司產(chǎn) 品) ， 抗 特 異 性 酪 氨 酸 殘 基 磷 酸 化 單 克 隆 抗 體 ( P Y 2 0 ) ( 美國 S o u t h e r nBA公司

9、產(chǎn)品) ， G e n i s t e i n( 4， 5 ， 7 一 三 羥 異 黃 酮 ) ( 瑞 士 A l e x i s 生 物 公 司 產(chǎn) 品) ， 硝酸纖維素膜( N C膜 ) ( 浙江四甲生化制品公 司產(chǎn)品) ， 次高分子量標準蛋 白質(zhì) ( 上海西 巴斯生 物 技術(shù) 公 司產(chǎn) 品 ) ， 蛋 白質(zhì) 標 準 溶 液 ( 晶美 生物 工 程公 司提供 ) ， We s t e r nb l o t t i n g試 劑 盒

10、( 武 漢 博 士德 生 物 公 司 產(chǎn) 品 ) ， L e u p e p t i n ( 亮 抑 蛋 白酶 肽 ) 、A p r o p t i n ( 抑蛋 白酶肽) 、 N P 一 4 0( 均為 A ME R S E R —C O進 口 分裝) ， 單克 隆抗體免疫熒光法衣原體特 異性診斷試劑盒 ( 軍事 醫(yī)學(xué)科學(xué) 院微生物 學(xué)檢測 中心產(chǎn)品) 。其 它試 劑均為 國產(chǎn)分 析純。Mc C o y細胞和沙眼衣原體( K血清型)

11、由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室提供。1 ． 2 方法 1 ． 2 ． 1 細胞培養(yǎng) 將 Mc C o y 細胞懸液接種于 5 0c m細 胞培 養(yǎng) 瓶 中 ， 加入 含 1 0％小 牛 血清 、 1％谷 氨酰胺、 雙抗 ( 青霉素 1 0 0U／ m L 、 鏈 霉素 1 0 0U ／mL ) 的 R P MI 一 1 6 4 0培養(yǎng)液 ( p I - I7 ． 0 ～7 ． 2 ) ， 置 3 7℃ ， 5％C ( ) 2 培養(yǎng) 箱

12、 中孵 育 2 4 -4 8h 、 細 胞培 養(yǎng) 成 單 層后 ， 用 H a n k s 液 洗 滌 細 胞后 ， 用 0 ． 0 2 ％E D —T A消化傳代 。1 ． 2 ． 2C t 的 增 殖 取 2 4孔 板 ， 每 孔 加 入 5 ×1 0／ m L單層 細胞 懸液 1m L ， 細 胞培 養(yǎng) 成單 層 后 ，吸去上清液， 用含放線菌酮( 終濃度為 2r ag ／ L ) 的磷酸緩沖液洗滌 3次 ， 各孔加入

13、2 0 0正 C ￡ 懸液，30 0 0r ／ m i n 離 心 3 0m i n ， 置 3 7 ℃ ， 5％ c o 2 培養(yǎng) 箱 中孵 育 2h后 ， 吸 去 上 清 液 ， 加 入 R P MI 一 1 6 4 0培養(yǎng) 基 ( 含 1 0％ 小 牛 血 清 、 2m g ／ L 放 線 菌 酮 、1％谷 氨酰胺 、 1 0 0U／ m L鏈 霉 素 ) ， 繼 續(xù) 置 3 7℃ ，5％ C o 2 培 養(yǎng) 箱 中 孵 育 7

14、2 h 后 ， 放 入 一7 0 ℃ 冰 收稿 日期 ： 2 0 0 4 一O 7一O 9作者簡介 ： 張小清 女 ， 醫(yī)學(xué)碩士 ， 副教授?，F(xiàn)研究方向為細胞因子對 衣原體的作用。* 通訊作者 維普資訊 http://www.cqvip.com 5 期 張小清等 ： g e n i s t e i n 對沙 眼衣 原體感 染細胞信 號轉(zhuǎn)導(dǎo) 的影響 75 0m g ／ L ， 抑制作用增強 ， 但不能完全抑制 I F N 一 7誘 導(dǎo)

15、 的 J A K1和 S TA T1的活化 。3討 論 Q 感染可引起多種疾病 ， 但分子機制 尚不十分 明了 。有 研 究 發(fā) 現(xiàn) ， 機 體 抵 抗 Q 感 染 與 機 體 的免 疫應(yīng) 答 有 關(guān) ， 宿 主 細 胞 抗 Q 感 染 對 于 I F N一7 ， T N F - a 等 細胞 因子具有 依賴性L 7J 。我 們 曾對 I F N一 7處 理 的 Q 感 染 細 胞 裂 解 提 取 物 進 行 免 疫 印跡 檢測 發(fā) 現(xiàn)

16、 ， I F N一 7能 誘 導(dǎo) 激 活 一 系 列 蛋 白 激 酶 的酪 氨酸 殘 基發(fā) 生 磷 酸化 ， 其 中包 含 有 與 I F N 一7 信 號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 有 關(guān) 的 多 種 酪 氨 酸 激 酶 ， 表 明 I F N 一 7作用 于 感 染 的 Mc C o y細 胞 與 J A K — S T A T 途 經(jīng)密 切 相 關(guān) 6。 I F N 一 7與 Q 感 染 細 胞 膜 上 的I F N 一 7 受 體結(jié) 合 ，

17、活 化 胞 漿 中 J A K 酪 氨 酸 蛋 白激 酶 J a n u sk i n a s e s ， J A K s ) ， 繼 而使 下 游 的信 號蛋 白— — “ 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子” ( s i g n a lt r a n s d u c —e r sa n da c t i v a t o r so ft r a n s c r i p t i o n ，S T AT s ) 磷 酸 化 ， 后者轉(zhuǎn)移入核 ， 結(jié)合

18、到特定基 因啟動子上 ， 調(diào) 節(jié) 相應(yīng) 基 因 的表 達 。G e n i s t e i n ( 4， 5 ， 7 一 三羥異黃酮) 是一種從大豆 中提取的化合物 ， 在體 內(nèi)外都具有特異性酪 氨酸 激 酶抑 制 劑 作 用 J 。故 用 g e n i s t e i n作 為 阻 斷 劑 與 I F N 一 7共 同 作 用 ， 以證 實 I F N 一 7在 誘 導(dǎo) 活 化 J A K ~ S T A T 通 路 中 的 作 用

19、 。 本 研 究 結(jié) 果 顯 示 ，g e n i s t e i n 還 可拮 抗 I F N一對 C t 增 殖 、 生 長 的抑 制 作 用 ， 表 現(xiàn) 出細胞 存 活率 增 高 ； g e n i s t e i n可 以 明顯 抑 制 I F N 一 7 作 用 下 的 Q 感 染 細 胞 中酪 氨 酸 激酶 蛋 白質(zhì)的表達 ， 也使下 游 的信 號蛋 白活化減弱 。這進一 步說 明 了 I F N 一作 用 的 Q 感 染

20、細 胞 中信 號轉(zhuǎn)導(dǎo) ， 可由酪氨酸蛋 白激酶途 徑介導(dǎo)完成 。但 g e n i s t e i n對 I F N一 7誘導(dǎo) 的蛋 白激 酶 酪 氨酸 活 化 不 能完 全 被 抑 制 ， 提 示 在 I F N 一 7對 Q 感 染 細 胞 的 信號 轉(zhuǎn)導(dǎo) 中可 能 存 在 有 非 酪 氨 酸 蛋 白激 酶途 徑 。可能是由于微生物 ( 例如衣原 體、 分支桿 菌、 沙門菌 、 單 核 細胞 增 多 性 李 氏菌 、 利 什 曼 原

21、 蟲 等 ) 感 染 機體后 ， 其結(jié)構(gòu)成分或代謝產(chǎn)物能直接影 響 I F N 一7誘 導(dǎo) 的 J A K， S T A T1的 活 化 5。另 外 ， Q 持 續(xù) 感染 釋 放 的抗 原物 質(zhì)有 可 能 刺激 細 胞產(chǎn) 生 細胞 因 子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子( S u p p r e s s o r so fc y t o k i n es i g —n a l i n g ， s o t s ) ， 影響了J A K — S T A T

22、途徑的誘導(dǎo)活 化 9 。但其確切機制 尚待進一步探討 。參 考 文 獻 [ 1 ]R o t t e nb e r g ， M． E ． R e g u l a t i o n a n dr o l eo fI F N - g a m m ai nt h eh a t e i mm u n i t yt om i c r o o r g e ni s m s [ J ] ． J ． C l i n ． I n v ~ t ． ， 2

23、 0 0 2 。i n n a t er e s i s t a n c et o i n f e c t i o nwi 出 C h l a my ~ ap n e t a n o n i a e 【 JJ ．1 0 9 ：1 2 7 1 ～1 2 7 7 ．J ． I m m u n o 1 ． 2 0 0 0 ， 1 6 4 ： 4 8 1 2 -4 8 1 8 ．[ 6 ] 張小清， 李建萍 。 余 平 ． 沙 眼衣原 體感

24、染細胞 中 I F N - 7 信 號 [ 2 ] Ma y e rJ ， Wo o d sML ，V a v r i nZ ， e ta 1 ． G a m m ai n t e r f e r o ni n ．通路的初 步研究[ J ] ． 微生物學(xué)雜志 ， 2 0 0 3 ， 2 3 ( 2 ) ： 5 -7 ．d u c e dn i t r i co x i d ep r o d u c t i o nr e d u c e

25、 sC h l a m y d i at r a c h om a t i si n 一[ 7 ] R o d e lJ ， G mhA。 V o g e h e ngH， 吐 a 1 ． B e t amt e r f e mni sp r o -f e c t i v i t y i n Mc C o yc el ~ [ J ] ． I ~e c tI m m u n ，1 9 9 3 。 6 1 ( 2 ) ： 4 9 1d u

26、e e db yC h l a m y d i au ~ c h om a t i si r d e ct e df i b mb l a s t - l i k es y n ．～ 4 9 7 ．o v i o cy t e s e ndi n h i b i t sg a mma - i n d u db l eHL A- DRe x p r e s s i o n[ 3 ]C o t t e r， T． W ． ， K． H．

27、R a m s e y 。 G ． S ． Mi r e np u r i ， e ta 1 ． D i s 一[ J ] ．I ~e ctI m m u n ， 1 9 9 8 ， 6 6 ( 9 ) ： 4 4 9 1 ～4 4 9 5 ．s e m i n a t i o no f C h l a m y d i a t r a c h o nm t i sc h r o n i cg e n i t a l ~ ' a

28、c t i r d e c ·[ 8 ] A k i y e nmT， I a h l d aJ ， N a k a y a w a S ， e ta 1 ． G e n i s t e i n 。 as p e c i f i ct i o ni ng a m m ai n t e r f e r o ng e n ek n o c k o u tm i c e [ J ] ． I n f e ct ． I m —i n h

29、 i b i t o r o ft y I 。 6 ． m e - s p e d 6 cp r o t e i nk i n a s e [ J ] ． JB i dC h ∞ 。m R n ． 。 1 9 9 7 ， 6 5 ： 2 1 4 5 ～2 1 5 2 ．1 9 8 7 ， 2 6 2 ( 1 2 ) ： 5 5 9 2 ～5 5 9 5 ．[ 4 ] S h a wAC 。 C h r i s t i s n s e n

30、 G， R o e l ~ t o r f f P 。 e ta 1 ． G e n e t i cd i f f e r 一[ 9 ] C l a r kJ N， S a n t o s MA， S t e v e s o nL E ， e ta 1 ． E f e c mo f t y I cee l ~ c e i n出eC h l a my d i a廿a c I ∞ n I a 凼 t r y p t op h o ns y

31、 n t h a ~ M p h a -k i n a s ei n h i b i t om o i lt hep r ol i f e r a t i o n o fb l r m a nb r e a s tc a n c e rs u b u n i tc a I le x p l a i nv a r i a t i o n si n ~ ． x o v s rp a t h o g e n e s i s [ J ]

32、． Mi — l i n e sa n dp r o t e i n si m p o r t a n t i nt her ∞f D ． I l i r l gp a t hw a y [ J ] ． Jc r o b e sI n f e ct ， 2 0 O 0。 2 ( 6 ) ：5 8 1 ～5 9 2 ．C a n c e r 。 1 9 9 6 。 6 5 ：1 8 6 ～1 9 1 ．[ 5 ] T h o m a sD

33、， S i l v i aS ， Ma r i n a K， e ta 1 ． I F N s e ndS T A T s i ni n ．Ro l e sO fGe n i s t e i no nS i g n a lTr a n s d u c t i o ni nCh l a my d i at r a c h o ma t i s ． I n f e c t e dCe l l sZ HANG Xi a o q i n g，

34、 YU Pi n( 1 ． De p a r t me n to fB i o c h e mi s t r y 。~ n g n e n Un i v e l ~ i t y。Hu n e n C h e n z h ou4 2 3 0 0 0。C h i n a ；2 ． De p a r t me nto fI mmu n o l o g y ， C e n t r a lS o u t h Un i v e r s i

35、t y，Hu n e n Ch e ng s h a 4 1 0 0 7 8 ，C h i n a )A b s t r a c tTh ea i m 0 壬 t h i ss t u d yi s t od e t e r mi n et h er o l eo fg e n i s t e i n，as p e c i f ici n h l b i t oro ft y r o n es p e c i f i cp r o

36、 t e i nk i n a s e 。o ns i g n a lp a t h w a yi nl a m y d l at r a c h o m a t i s ( C t ) s e r o t y p eKi n f e c t e dc e i l su n d e rt h es t i mu l a t i o no fI F N - 丫 ． T h eC ti n f e c t e dM c C o yc e l

37、 l swe r et r e a t e dwi t hI FN- 7 ．Tr y p a n b l u ed y ee x c l u s i o nt e s twe rea p p l i e dt o d e t e r m i n et h es u r v i v a lr a t eo ft h eQ i n ．f e c t e dc e i l sa n dWe s t e r nb l o ta s

38、s a yw e rep e r f o r me dt o @ ~ x a m met hel e v e l so fp r o t e i nt y r o s i n ek i na s ep h o s p h o r y l a t i o na n dJ A K1 ／S TAT1a c t i v a t i o ni nt h eC ti n f e c t e dc e l l s ．Ge n i s t e i nc

39、 o u l da n t a g o n i z et h ee f f e c to f I F N． 7d e e re a s ~ a gt h es u r v i v a lr a t eo ft h e(i n f e c t e dc e l l swi t h ad o s a g ed e p e n d e n tp a t t e r n ．Ge n i s t dnh a da c t iv i t i e

40、 st o i n h i b i tt hep h o s p h o r y l a t i o no fp r o t e i nt y r o s mek i n a s ea n da c t i v a t i o no fJ A K1 ／ S TA T 1i n d u c e db yI F N ． 7i nt heQ i n f e c t e dc e l l sa n dt hea c t i v i t i

41、e s w e red o s e l yr e l a t i v et o t heu s e dg e n i s t e i nd o s a g e s ．Ke y wo r d sp r o t e i nt y r o s i n ek i na s e ，i n h i b i t or ，C 7 l l amy d i at r a c h o ma t l s，I FN· 7 ，t r a n s d