應(yīng)力、電磁刺激對(duì)骨骼內(nèi)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及機(jī)制研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(OP)是最為常見(jiàn)的臨床疾病之一,以骨量下降和骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞為特征,表現(xiàn)為骨的脆性增加和骨折風(fēng)險(xiǎn)的大大提高。OP的誘發(fā)因素眾多,以衰老、性激素缺乏、應(yīng)力刺激不足、營(yíng)養(yǎng)不良、糖尿病所誘發(fā)的OP最為常見(jiàn)。隨著我國(guó)人口老齡化速度的加劇,OP給我國(guó)帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)也逐年加重。因此,只有對(duì)骨骼及其內(nèi)部細(xì)胞的生物學(xué)特征進(jìn)行更全面而深入的認(rèn)識(shí),才能進(jìn)一步深入了解OP的發(fā)生機(jī)制,為臨床治療OP提供更科學(xué)而有力的依據(jù)。
　　應(yīng)力和電

2、磁場(chǎng)是骨骼在日?；顒?dòng)中所承受的最常見(jiàn)的兩種物理因子,它們對(duì)于機(jī)體的骨骼代謝及骨健康狀態(tài)有著重要的影響。首先,骨骼是機(jī)體的應(yīng)力承載系統(tǒng),它能夠調(diào)整和改變自身的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以適應(yīng)外界應(yīng)力刺激的變化(Wolff定律)。而骨骼上的應(yīng)力負(fù)荷不足或骨骼自身應(yīng)力響應(yīng)能力的衰退是誘發(fā)OP的主要原因之一。但是,骨適應(yīng)原理的具體機(jī)制目前尚不明確。骨是以何種形式將外界的應(yīng)力信號(hào)傳遞至骨骼內(nèi)部的細(xì)胞的,骨骼內(nèi)的細(xì)胞又是如何感應(yīng)這些刺激并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)部的生物化學(xué)

3、信號(hào)的,這些骨力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究領(lǐng)域的重要的疑問(wèn)目前仍不明確。其次,骨骼處于復(fù)雜的電磁微環(huán)境中,而外界應(yīng)力也會(huì)在骨骼內(nèi)產(chǎn)生電磁信號(hào)的改變(骨骼“壓電效應(yīng)”),Bassett于1977年首次將外源性的脈沖電磁場(chǎng)（PEMF)引入臨床成功的治療骨不連,并預(yù)測(cè)外源性的電磁刺激可能作為一種經(jīng)濟(jì)、無(wú)創(chuàng)、副作用小的物理治療方法用于臨床OP的治療。但是PEMF作用的骨骼內(nèi)的靶細(xì)胞是什么,其具體作用的信號(hào)通路傳導(dǎo)機(jī)制是什么,目前仍不明確。
　　本研究

4、首先以細(xì)胞中最重要的第二信使分子—鈣信號(hào)作為突破口,發(fā)現(xiàn)了應(yīng)力刺激下體外骨細(xì)胞(OCY)網(wǎng)絡(luò)具有獨(dú)特的多鈣尖峰鈣信號(hào)響應(yīng)特性,并且OCY網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)力敏感性要遠(yuǎn)高于成骨細(xì)胞(OB),這一發(fā)現(xiàn)為證實(shí)OCY網(wǎng)絡(luò)是骨骼中感受應(yīng)力刺激的核心組件提供了有力的依據(jù)。其次,我們對(duì)分離培養(yǎng)的脛骨組織進(jìn)行動(dòng)態(tài)載荷刺激,觀察原位OCY網(wǎng)絡(luò)的鈣信號(hào)動(dòng)力學(xué)特征,我們?cè)趪?guó)際上首次發(fā)現(xiàn)了原位OCY響應(yīng)應(yīng)力刺激的多鈣尖峰特性,而骨陷窩—小管系統(tǒng)中的組織液流動(dòng)是誘發(fā)OCY

5、信號(hào)響應(yīng)的主要內(nèi)在驅(qū)動(dòng)力,而OCY網(wǎng)絡(luò)正是通過(guò)組織液流動(dòng)所誘發(fā)的鈣信號(hào)來(lái)響應(yīng)和處理外界的應(yīng)力刺激的。第三,我們分別構(gòu)建去勢(shì)(高骨轉(zhuǎn)換)及胰島素依賴型糖尿病(低骨轉(zhuǎn)換)的OP動(dòng)物模型,施加外源性的PEMF刺激以觀察其作用效果及相關(guān)的機(jī)制。PEMF對(duì)于兩種因素誘發(fā)的骨丟失都有很顯著的緩解作用, PEMF對(duì)于骨形成的促進(jìn)作用明顯,而對(duì)于骨吸收的作用不顯著,而 OB的Wnt/LRP5/β-catenin信號(hào)通路則是PEMF發(fā)揮其作用的主要信號(hào)通

6、路。該研究不僅極大的豐富了我們對(duì)骨骼力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和電磁信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其機(jī)制的認(rèn)識(shí),并且為應(yīng)力和電磁刺激在臨床抗OP的應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。整個(gè)研究分為以下三個(gè)部分:
　　第一部分:流體剪切力誘發(fā)的體外骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)鈣信號(hào)響應(yīng)時(shí)空動(dòng)力學(xué)特征研究
　　背景:OCY位于充滿組織液的骨陷窩—小管系統(tǒng)(LCS)中,它們憑借獨(dú)特的細(xì)胞突觸彼此相連形成骨骼內(nèi)廣闊的OCY網(wǎng)絡(luò),科學(xué)家們推測(cè)這個(gè)骨基質(zhì)內(nèi)廣闊的OCY網(wǎng)絡(luò)是響應(yīng)外界力學(xué)刺激的主要組件

7、。但是,目前仍未見(jiàn)對(duì)于OCY和骨骼中其它細(xì)胞(如OB)力學(xué)敏感性的系統(tǒng)的比較和研究。
　　方法:采用微接觸壓印和自組裝單分子表面化學(xué)技術(shù)構(gòu)建體外OCY和OB細(xì)胞網(wǎng)絡(luò),細(xì)胞表面施加流體剪切力,實(shí)時(shí)觀察兩種細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的鈣信號(hào)響應(yīng);開(kāi)發(fā)基于獨(dú)立成分分析(ICA)的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)鈣信號(hào)自動(dòng)提取算法提取兩種細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)鈣信號(hào),并基于該算法分析細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)鈣信號(hào)時(shí)空動(dòng)力學(xué)特征。
　　結(jié)果:流體剪切力誘發(fā)OCY細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生獨(dú)特的多鈣尖峰鈣信號(hào)響應(yīng),而大多

8、數(shù)OB主要表現(xiàn)為單一的鈣主峰;同等強(qiáng)度剪切力作用下, OB的鈣響應(yīng)尖峰數(shù)量顯著低于OCY;OCY和OB的鈣信號(hào)時(shí)空特征參數(shù)隨應(yīng)力強(qiáng)度的增加線性增加;OCY細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)與OB細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在響應(yīng)和處理應(yīng)力刺激所表現(xiàn)的鈣信號(hào)時(shí)空動(dòng)力學(xué)特征顯著不同,OCY細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)比OB細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)具有更顯著的時(shí)間域鈣信號(hào)振蕩特征和更高的空間域鈣信號(hào)相關(guān)性和鈣尖峰同步性,且其空間同步性依賴于細(xì)胞的間隔距離;相比傳統(tǒng)的手動(dòng)鈣信號(hào)分析法,我們開(kāi)發(fā)的基于ICA的自動(dòng)分析算法節(jié)省了

9、巨大的工作量,且準(zhǔn)確性更高,該算法具有在鈣信號(hào)分析研究領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用前景。
　　結(jié)論:OCY細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)比OB細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)具有更高的應(yīng)力響應(yīng)敏感性,最直接的證實(shí)了OCY細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)是響應(yīng)外界力學(xué)刺激的核心組件。
　　第二部分:小鼠脛骨周期載荷作用下原位骨細(xì)胞鈣信號(hào)響應(yīng)及其作用的相關(guān)機(jī)制
　　背景:OCY位于獨(dú)特的LCS微環(huán)境中,骨是如何將外界應(yīng)力轉(zhuǎn)為細(xì)胞水平的應(yīng)力信號(hào)的,OCY是如何感受力學(xué)信號(hào)并將其轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)信號(hào)的,

10、目前仍不得而知。深入探究這些問(wèn)題,對(duì)于更全面、深入的了解OCY力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和骨適應(yīng)的機(jī)制具有重要的意義。
　　方法:離體培養(yǎng)小鼠脛骨,使用自行開(kāi)發(fā)的應(yīng)力加載系統(tǒng)施加生理水平應(yīng)力,采用激光掃描共聚焦采集和應(yīng)力加載同步技術(shù)實(shí)時(shí)觀測(cè)脛骨內(nèi)OCY鈣信號(hào)響應(yīng),有限元分析結(jié)合微應(yīng)變片測(cè)量技術(shù)測(cè)定骨表面的應(yīng)變變化,熒光漂泊恢復(fù)技術(shù)結(jié)合計(jì)算模型分析骨陷窩—小管系統(tǒng)中液體流速,使用鈣信號(hào)通路拮抗劑分析OCY鈣響應(yīng)的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:OB具

11、有自發(fā)的鈣信號(hào)響應(yīng),OCY基本沒(méi)有自發(fā)的鈣響應(yīng)。應(yīng)力刺激誘發(fā)原位OCY產(chǎn)生多鈣尖峰的鈣信號(hào)響應(yīng),OB對(duì)應(yīng)力作用不敏感;骨LCS中的液體流速隨應(yīng)力線性增加,且細(xì)胞突觸流速顯著高于細(xì)胞體;OCY鈣信號(hào)特征參數(shù)與組織間隙液流速線性相關(guān);細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)和ATP相關(guān)的P2R/PLC/IP3信號(hào)通路在OCY鈣信號(hào)響應(yīng)中發(fā)揮主要作用。
　　結(jié)論:外界應(yīng)力以骨LCS中的間隙組織液流動(dòng)的形式作用于OCY,OCY網(wǎng)絡(luò)通過(guò)間隙組織液流動(dòng)誘發(fā)的獨(dú)特的多鈣

12、尖峰鈣信號(hào)來(lái)響應(yīng)和處理外界的應(yīng)力刺激,細(xì)胞外ATP及其相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)P2R/PLC/IP3通路是OCY鈣響應(yīng)最重要的信號(hào)通路。該研究揭開(kāi)了原位OCY力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究序幕,為證實(shí)“OCY是骨骼中最主要的應(yīng)力信號(hào)響應(yīng)元件”這一猜想提供了最直接而有力的證據(jù)。
　　第三部分:脈沖電磁場(chǎng)對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠骨丟失的抑制作用及機(jī)制研究
　　背景:骨中細(xì)胞的生物學(xué)特征受到周圍電磁環(huán)境的影響,而外源性PEMF刺激可以顯著促進(jìn)骨生成。一些臨床研

13、究表明PEMF能夠抑制OP患者的骨丟失。但PEMF對(duì)于OP的作用效果仍缺乏系統(tǒng)的研究,PEMF在骨中的作用靶點(diǎn)及其相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制目前仍不清楚,這些限制了其科學(xué)而廣泛的臨床應(yīng)用。
　　方法:設(shè)計(jì)一套多波形輸出的、“3-HelmHolz線圈”電磁場(chǎng)發(fā)生系統(tǒng),分別構(gòu)建去勢(shì)和胰島素依賴型糖尿病大鼠OP模型,分別評(píng)價(jià)大鼠體質(zhì)量、反映骨代謝的血清生物化學(xué)指標(biāo)、骨生物力學(xué)強(qiáng)度、骨微觀結(jié)構(gòu)、骨骼中Wnt、Lrp5、β-catenin、RANK

14、L和RANK的mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:PEMF對(duì)去勢(shì)及糖尿病大鼠骨量丟失及小梁骨微結(jié)構(gòu)衰退具有顯著的抑制作用,并能改善骨的生物力學(xué)性能。血清生化指標(biāo)分析表明,PEMF能夠調(diào)控去勢(shì)及糖尿病大鼠的骨生成行為,但對(duì)骨吸收的作用不明顯。同時(shí),PEMF能夠顯著提高其骨骼中的Wnt1,LRP5及β-catenin的mRNA水平,但是對(duì)RANKL和RANK表達(dá)的影響不明顯。
　　結(jié)論:PEMF作為一種經(jīng)濟(jì)、無(wú)創(chuàng)、副作用小的物理治療方法