CD73對(duì)人乳腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、腫瘤擴(kuò)散(或腫瘤轉(zhuǎn)移)是指惡性腫瘤細(xì)胞由原發(fā)部位向周圍組織的侵襲和向不連續(xù)的遠(yuǎn)隔部位或器官的轉(zhuǎn)移。腫瘤擴(kuò)散是癌癥患者死亡的最主要原因，也是腫瘤惡性的重要標(biāo)志和最本質(zhì)的表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤擴(kuò)散是一系列具有內(nèi)在聯(lián)系的多個(gè)步驟相互作用、多個(gè)因素共同參與的結(jié)果。而腫瘤細(xì)胞的黏附、侵襲及運(yùn)動(dòng)等惡性生物學(xué)行為在腫瘤擴(kuò)散中發(fā)揮極其重要的作用。 CD73又稱為胞外．5’．核苷酸酶(Ecto-5’-Nucleotidase，EC3．13．5，ec

2、to-5'-NT)，通過糖基．磷脂酰肌醇錨定于細(xì)胞膜外表面，其功能可以分為兩部分：一是水解酶活性，參與嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成途徑，水解AMP生成腺苷；另一個(gè)是非酶活性，參與細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞黏附等生理功能。 近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，CD73與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。臨床研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中CD73的表達(dá)和活性明顯增高，尤其是已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中CD73的升高更為顯著。雌激素受體陰性的乳腺癌較易發(fā)生轉(zhuǎn)移，而雌激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞的

3、CD73表達(dá)明顯高于雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞，二者呈負(fù)相關(guān)。本研究以此為線索，檢測(cè)了不同惡性程度的乳腺癌細(xì)胞株中CD73的基因表達(dá)和活性，同時(shí)也進(jìn)一步深入研究了CD73對(duì)乳腺癌細(xì)胞黏附、侵襲和運(yùn)動(dòng)能力的影響及其機(jī)制。 本文主要使用：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、高效液相層析法(highperformanceliquidchromatography，HPLCl、Westernblot、RT-PCR、體外侵襲力實(shí)驗(yàn)、體外運(yùn)動(dòng)力實(shí)驗(yàn)、體外黏附力實(shí)驗(yàn)、

4、ELISA等研究方法。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高度惡性人乳腺癌細(xì)胞株BT549、MDA231、MDA-MB-435的CD73基因表達(dá)和酶活性明顯高于低度惡性腫瘤細(xì)胞株T-47D。用脂質(zhì)體將質(zhì)粒pcDNA-NT5E轉(zhuǎn)染T-47D細(xì)胞以后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞Trans-T-47D的CD73mRNA表達(dá)和CD73活性顯著升高，并且其侵襲力、運(yùn)動(dòng)力以及對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的黏附力也明顯增強(qiáng)。 轉(zhuǎn)染細(xì)胞Tr

5、ans-T-47D進(jìn)一步用CD73的特異性抑制劑α，β-亞甲基二磷酸腺苷(alpha，beta-methyleneADP，APCP)孵育，結(jié)果顯示，APCP可以抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲力、運(yùn)動(dòng)力和黏附力；APCP孵育后再加入腺苷發(fā)現(xiàn)，腺苷可以逆轉(zhuǎn)APCP對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的抑制作用。腺苷也能增強(qiáng)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞T-47D的侵襲力、運(yùn)動(dòng)力及黏附力，這種促進(jìn)作用呈劑量依賴性。 表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelialgrowthfactorrecepto

6、r,EGFR)與乳腺癌患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞CD73的表達(dá)和EGFR的表達(dá)具有相關(guān)性；低表達(dá)CD73的乳腺癌細(xì)胞通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)CD73后，其EGFR的mRNA和蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)。 白介素．8(interleukin-8，IL-8)可以增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)首先觀察到，乳腺癌細(xì)胞株CD73的表達(dá)和其培養(yǎng)液中IL-8的蛋白含量相關(guān)；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞Trans-T-47DC

7、D73表達(dá)增強(qiáng)后其IL-8的mRNA表達(dá)和培養(yǎng)液中IL-8的蛋白含量也顯著升高。 文獻(xiàn)報(bào)道，EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑能上調(diào)IL-8的表達(dá)。為了驗(yàn)證在過表達(dá)CD73的轉(zhuǎn)染細(xì)胞培液中IL-8含量升高是否與表皮生長(zhǎng)因子有關(guān)，我們?cè)谵D(zhuǎn)染細(xì)胞培液中加入了表皮生長(zhǎng)因子。結(jié)果顯示，加入表皮生長(zhǎng)因子后IL-8含量沒有明顯變化。說明在過表達(dá)CD73的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，是CD73表達(dá)增強(qiáng)促進(jìn)了IL-8的合成，而與表皮生長(zhǎng)因子無關(guān)。 分別用APCP和C

8、D73的單克隆抗體1．E9孵育轉(zhuǎn)染細(xì)胞Trans-T-47D，結(jié)果顯示，APCP和1一E9都不能影響轉(zhuǎn)染細(xì)胞培液中IL-8的蛋白含量。表明CD73促進(jìn)IL-8的合成并非通過腺苷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，也不受1．E9結(jié)合位點(diǎn)的影響。 基于上述結(jié)果我們得出以下結(jié)論：1．人乳腺癌細(xì)胞CD73的表達(dá)和活性與腫瘤的惡性程度有關(guān)；2．CD73增強(qiáng)人乳腺癌細(xì)胞的侵襲力、運(yùn)動(dòng)力和黏附力；3．CD73通過產(chǎn)生腺苷促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的黏附、侵襲和運(yùn)動(dòng)；4．CD