Nestin與乳腺癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性及其對乳腺癌生物學(xué)行為的影響.pdf

1、乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，是女性癌癥的主要死亡原因。我國每年乳腺癌新發(fā)病例和死亡病例分別占全世界的12.2％和9.6％，癌癥死亡原因位居第六，極大地威脅著女性的身心健康。目前以手術(shù)治療、化療、放療及內(nèi)分泌治療為主的綜合治療已成為抗乳腺癌的常規(guī)治療手段，但對于雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及人表皮生長因子受體2(Her2)表達(dá)缺失或低表達(dá)的三陰型(triple negative breast carcinoma，TNBC

2、)乳腺癌，常規(guī)的化療方案效果較差，目前尚無針對性的個(gè)體化治療方案，而且TNBC約占所有乳腺癌的10％-17％，且容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，因此TNBC逐漸成為臨床乳腺癌研究關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　巢蛋白(Nestin)是細(xì)胞骨架蛋白的一種。細(xì)胞骨架蛋白主要包括微絲、中間絲和微管。中間絲蛋白(IF)分為6個(gè)亞型，Nestin是最晚被識別的最大的中間絲蛋白。Nestin在哺乳動物的干細(xì)胞和前體細(xì)胞系中高表達(dá)，是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志表達(dá)分子。研究發(fā)

3、現(xiàn)Nestin在多種腫瘤組織中也有表達(dá)，如膠質(zhì)瘤，黑色素瘤，橫紋肌肉瘤，胃腸間質(zhì)腫瘤(GIST)，前列腺癌，胰腺癌，肺癌及乳腺癌，且Nestin的表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展及惡性程度有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道Nestin陽性的乳腺癌患者組織學(xué)分級均為Ⅲ級，下調(diào)Nestin能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲。國內(nèi)關(guān)于Nestin與乳腺癌的研究較少，因此從臨床及細(xì)胞分子水平深入研究Nestin在乳腺癌中的表達(dá)及其對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響對于研究

4、乳腺癌的發(fā)病機(jī)制及尋找TNBC有效的治療策略具有重要的臨床意義。
　　目的：
　　本研究旨在探討Nestin的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系、乳腺癌的預(yù)后分析及其對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為臨床治療乳腺癌探索新的生物學(xué)靶點(diǎn)。
　　第一部分，通過在組織學(xué)水平上檢測Nestin的表達(dá)情況，分析其與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　第二部分，通過在細(xì)胞分子水平觀察siRNA沉默Nestin基因的表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞

5、系生物學(xué)行為的影響，明確Nestin在乳腺癌發(fā)展過程中的作用，為臨床治療乳腺癌探索新的生物學(xué)靶點(diǎn)。
　　方法：
　　一、研究對象
　　109乳腺癌標(biāo)本來源于2006年1月至2007年9月間就診于中國醫(yī)科大學(xué)附第一屬醫(yī)院并行乳腺癌根治術(shù)治療的女性乳腺癌患者，平均年齡51.03±9.49歲（32-79歲）。納入標(biāo)準(zhǔn):1、所有患者均行乳腺癌根治性手術(shù);2、所有切除標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢測;3、患者的臨床病理資料及隨訪資料完整。

6、所有患者均簽署知情同意書，實(shí)驗(yàn)通過了中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。
　　人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-2311株。
　　二、藥品與試劑
　　鼠源性單克隆抗人Nestin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司、小鼠即用型免疫組織化學(xué)SP試劑盒(SP-9002)及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(FBS，Hyclone)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone)購自沈

7、陽博瑞得生物科技有限公司;Lipofectamine2000購自Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA); Nestin-siRNA和control-siRNA由Santa Cruz Biotech生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成;RNAiso Plus Total RNA提取試劑(B5005-1)、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒均購自TaKaRa公司;細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(cat: KGP150)購自

8、凱基生物技術(shù)公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）(P0010S)及細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1052)均購自碧云天生物技術(shù)公司，ECL發(fā)光試劑盒購自Thermo公司。
　　三、方法
　　1.免疫組織化學(xué)SP法檢測乳腺癌組織中Nestin蛋白的表達(dá)。
　　2.完全培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞。
　　3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行。
　　4.R

9、eal time-PCR和Western Blot驗(yàn)證Nestin基因沉默效率。
　　5.MTT實(shí)驗(yàn)檢測Nestin基因沉默后細(xì)胞增殖能力的變化。
　　6.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Nestin基因沉默后細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　7.PI染色檢測Nestin基因沉默后細(xì)胞周期及凋亡的變化。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包(Version17.0，Chicago，IL，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)

10、量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，Nestin的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的組間差異性采用卡方檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法進(jìn)行;生存資料及中位生存時(shí)間采用Kaplan-Meier方法描述，生存率組間比較采用log-rank檢驗(yàn);以p＜0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、乳腺癌中Nestin表達(dá)與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性研究
　　1.10

11、9例乳腺癌標(biāo)本中Nestin的陽性表達(dá)率為37.61％(41/109)，Nestin的表達(dá)在不同年齡、組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p值均＞0.05)。
　　2.三陰型乳腺癌患者Nestin表達(dá)率高于非三陰型乳腺癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(54.05％ vs29.16％，p=0.011)。
　　3.Nestin在ER陰性組、PR陰性組表達(dá)率高于ER陽性組及PR陽性組(P=0.011，P=0.036);HER2

12、陽性組Nestin表達(dá)率高于HER2陰性組，但兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（52.38％ vs34.09％，p=0.120）。
　　4.與Nestin陰性表達(dá)的患者相比，Nestin陽性組患者的中位無病生存期（DFS，49.49個(gè)月）短于Nestin陰性組（59.13個(gè)月）。Kaplan-Meier生存曲線顯示，Nestin陽性組患者無病生存率低于Nestin陰性組p=0.014，log-rank test)。
　　二、siRN

13、A介導(dǎo)的Nestin基因沉默對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　1.Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示siRNA-Nestin組中Nestin基因的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　2.與siRNA-NC組相比，siRNA-Nestin組細(xì)胞增殖能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(68.49％±3.10％ vs93.52％±1.31％，p＜0.05)。

14、>　　3.與siRNA-NC組相比，siRNA-Nestin組穿過基底膜至下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（12.33±5.51 vs42.33±7.01，p＜0.05）。
　　4.與siRNA-NC組相比，siRNA-Nestin組處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)明顯增多（53.11％±1.30％ vs20.29％±1.15％，p＜0.05）;siRNA-nestin組凋亡細(xì)胞比例明顯增高(43.62％±3.12％ vs20.84％