14-3-3θ對乳腺癌惡性生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　近幾年，隨著人們生活水平的提高，乳腺癌的發(fā)病率也迅速的增長著，目前乳腺癌已逐步成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，對女性的健康造成嚴(yán)重危害[1]。乳腺癌的治療模式隨著循證醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，已經(jīng)從傳統(tǒng)的手術(shù)治療轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)在的多種方式綜合治療，乳腺癌患者的預(yù)后得到顯著改善。但是由于乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移和對靶向藥物及化療藥物的耐藥，導(dǎo)致乳腺癌患者最終復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。所以尋找乳腺癌有效的治療靶點和預(yù)后預(yù)測因子，將會為乳腺癌

2、的治療提供新的策略。
　　14-3-3蛋白家族廣泛表達(dá)于真核生物細(xì)胞，是一類高度保守的小分子多功能酸性二聚體蛋白。14-3-3蛋白家族包括由七個不同基因編碼而成的七個亞型(β、γ、ε、σ、ε、ζ和δ)，它們在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝、細(xì)胞周期與凋亡等方面發(fā)揮作用[2]?，F(xiàn)有研究表明，14-3-3蛋白家族的七個亞型中唯有14-3-3σ可以通過減少真核細(xì)胞核輸出核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）從而發(fā)揮對腫瘤的抑制作用[3]，

3、其他亞型分別與不同腫瘤細(xì)胞的侵襲、增殖、遷移正相關(guān)[4]。腦膜瘤中14-3-3ζ亞型高表達(dá)，并隨著腦膜瘤的惡性程度升高其表達(dá)水平逐步增加，14-3-3ζ與腦膜瘤的惡化相關(guān)[5]。有研究提示14-3-3ζ的表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，推測14-3-3ζ可能是乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的一個潛在預(yù)測分子[6]。但是14-3-3ζ對乳腺癌生物學(xué)行為的影響及其潛在的分子機(jī)制仍不明確。那么14-3-3ζ對乳腺癌細(xì)胞的增殖、周期和凋亡有何影響？14-3-3ζ

4、與乳腺癌的預(yù)后有無關(guān)聯(lián)？14-3-3ζ能否成為乳腺癌新的治療靶點？帶著這些問題，我們首先構(gòu)建并篩選了過表達(dá)14-3-3ζ的乳腺癌細(xì)胞，然后進(jìn)行了14-3-3ζ對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響及其機(jī)制的探索。
　　研究方法和結(jié)果：
　　1.構(gòu)建并篩選過表達(dá)14-3-3ζ的乳腺癌細(xì)胞系：將訂購的pENTR3C DUAL載體中14-3-3ζ基因重組至真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA4.0中，用重組后的真核過表達(dá)載體pcDNA4.0-14-3-

5、3ζ轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，western blot進(jìn)行鑒定，將重組成功的真核表達(dá)載體pcDNA4.0-14-3-3ζ轉(zhuǎn)染AU-565、MCF-7和BT-474，抗生素篩選，經(jīng)過篩選的乳腺癌細(xì)胞通過western blot鑒定，成功構(gòu)建過表達(dá)14-3-3ζ的乳腺癌細(xì)胞系。
　　2.14-3-3ζ對乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究：（1）western blot實驗檢測14-3-3ζ在五株乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平（2）MTT實驗分別檢測 M

6、CF-7和AU-565過表達(dá)14-3-3ζ后的細(xì)胞增殖活性的變化；（3）平板克隆實驗分別檢測MCF-7和AU-565過表達(dá)14-3-3ζ后克隆形成能力的變化；（4）流式細(xì)胞儀分別檢測MCF-7和AU-565過表達(dá)14-3-3ζ后細(xì)胞凋亡的差異變化；（5）劃痕實驗分別檢測MCF-7和AU-565過表達(dá)14-3-3ζ后細(xì)胞遷移能力的變化；（6）分別通過用過表達(dá)14-3-3ζ的乳腺癌細(xì)胞MCF-7和AU-565荷瘤裸鼠，觀察實驗14-3-3ζ

7、表達(dá)升高與否對裸鼠移植瘤生長的作用，取瘤體行免疫組織化學(xué)染色，觀察相應(yīng)指標(biāo)的變化。結(jié)果：14-3-3ζ在五株乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)存在差異，這種差異可能和乳腺癌細(xì)胞的惡性程度相關(guān)。14-3-3ζ的表達(dá)升高可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、克隆形成能力、減少乳腺癌細(xì)胞的凋亡以及促進(jìn)裸鼠移植瘤的生長，綜上所述，14-3-3ζ可以促進(jìn)乳腺癌的惡性生物學(xué)行為。MCF-7和AU-565過表達(dá)14-3-3ζ后對阿霉素，他莫昔芬，赫賽汀敏感性的變化研究：細(xì)胞

8、殺傷曲線分別檢測MCF-7和AU-565過表達(dá)14-3-3ζ后對不同濃度梯度阿霉素，他莫昔芬，赫賽汀敏感性的變化。結(jié)果：14-3-3ζ表達(dá)升高可以降低MCF-7對阿霉素的敏感性，能夠降低ER陽性乳腺癌細(xì)胞MCF-7對他莫昔芬的敏感性，還可以降低HER-2陽性乳腺癌細(xì)胞AU-565對赫賽汀的耐藥性。14-3-3ζ過表達(dá)引起HER-2陽性乳腺癌細(xì)胞AU-565對赫賽汀的敏感性差異最為明顯。
　　3.14-3-3ζ表達(dá)升高引起乳腺癌對阿

9、霉素、他莫昔芬及赫賽汀敏感性降低的機(jī)制初探：（1）western blot檢測14-3-3ζ表達(dá)升高與否對AU-565和MCF-7對mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt等蛋白表達(dá)水平的影響。用赫賽汀分別處理表達(dá)不同水平14-3-3ζ的AU-565，western blot檢測Bcl-2、Bax和PARP等相關(guān)蛋白表達(dá)的變化；（2）分別用表達(dá)不同水平14-3-3ζ的HER-2陽性乳腺癌細(xì)胞BT-474注射裸鼠成瘤，然后給予裸鼠赫賽汀

10、處理，觀兩組裸鼠瘤體對赫賽汀治療的敏感性，取瘤體免疫組織化學(xué)染色觀察相應(yīng)蛋白的表達(dá)差異。結(jié)果：14-3-3ζ降低乳腺癌細(xì)胞對阿霉素、他莫昔芬及赫賽汀的敏感性作用可能與Akt和mTOR的活化增多有關(guān)，其中14-3-3ζ的過表達(dá)能夠下調(diào)HER-2陽性乳腺癌對赫賽汀的敏感性很可能與Akt和mTOR的活化增多，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與PARP的表達(dá)升高，Bax表達(dá)下降有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.五株乳腺癌細(xì)胞系14-3-3ζ的表達(dá)水