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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
構(gòu)建鈣網(wǎng)織蛋白(calreticulin，CRT)基因的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)質(zhì)粒載體，應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)存的CRT重組腺病毒載體，分別上調(diào)和下調(diào)乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中鈣網(wǎng)織蛋白的表達(dá)。觀察對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響，誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)及侵襲能力的改變，并初步探討其可能機(jī)制。
方法:
設(shè)計(jì)并合成針對(duì)CRT基因的shRNA鏈，退火形成雙鏈，與酶切的
2、質(zhì)粒pGPU6/GFP連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5a菌株，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、質(zhì)粒pGPU6/GFP空載體組、下調(diào)組和上調(diào)組。采用實(shí)時(shí)定量PCR法(Real time-PCR，RT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞CRT基因的表達(dá)情況;Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞CRT蛋白的表達(dá)情況;MTT法檢測(cè)各處理因素對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響;Annexin Ⅴ-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況;Tr
3、answell法檢測(cè)各處理因素對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。
結(jié)果:
本研究成功構(gòu)建了真核質(zhì)粒載體pGPU6-CRTshRNA，并成功導(dǎo)入到乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中，RT-PCR檢測(cè)CRTmRNA表達(dá)和Westernblot檢測(cè)CRT蛋白表達(dá)均已得到證實(shí)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，pGPU6-CRTshRNA明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，其余對(duì)照組無明顯作用。AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染流式細(xì)胞
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