TET1調(diào)節(jié)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株生物學(xué)行為的研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，其發(fā)病率及死亡率在我國(guó)及全世界呈上升趨勢(shì)。盡管放療、化療、分子靶向治療及多種生物治療手段有了長(zhǎng)足發(fā)展，但乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等仍然是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的重要原因。因此，探索乳腺癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制成為現(xiàn)今的研究熱點(diǎn)。越來(lái)越多證據(jù)表明，TET1（ten-eleven translocation1）是催化DNA去甲基化過(guò)程的重要蛋白，可通過(guò)促使5-甲基胞嘧啶（5mC）轉(zhuǎn)化為5-羥

2、甲基胞嘧啶（5hmC），參與 DNA去甲基化和相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程。在人類實(shí)體腫瘤中，TET1基因突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著顯著相關(guān)性，積極探索其與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，將為治療乳腺癌提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　為此，本研究以人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株為模型，通過(guò)建立過(guò)表達(dá)TET1的MDA-MB-231細(xì)胞株，研究TET1對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)行為的影響，并初步探究其相關(guān)分子機(jī)制，旨在為臨床預(yù)防和治

3、療腫瘤尋找新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1應(yīng)用慢病毒載體，建立 TET1過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（ MDA-MB-231-TET1）及攜帶 eGFP的陰性對(duì)照組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（MDA-MB-231-negative control，MDA-MB-231-NC），SYBR Green法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TET1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，Western blot法檢測(cè)TET1在蛋白水平的表達(dá)情況。
　　2倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)

4、，以 MDA-MB-231-NC作為陰性對(duì)照組，以MDA-MB-231作為空白對(duì)照組，應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)過(guò)表達(dá) TET1對(duì) MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響，應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)TET1對(duì)細(xì)胞周期的影響，應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及 TranswellTM小室檢測(cè)TET1對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，并應(yīng)用免疫熒光及Western blot檢測(cè)TET1與EMT相關(guān)蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-cate

5、nin）分子的表達(dá)。
　　3將MDA-MB-231-TET1、MDA-MB-231-NC及MDA-MB-231三組細(xì)胞分別接種于裸鼠腋下，建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，比較三組細(xì)胞成瘤時(shí)間、瘤體體積及質(zhì)量，并繪制生長(zhǎng)曲線。
　　4應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩獨(dú)立樣本的比較應(yīng)用成組 t檢驗(yàn)分析，多組間均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用 mean±SD表示，每組實(shí)驗(yàn)不少于3個(gè)獨(dú)立樣本的重復(fù)，以P<

6、0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1成功建立過(guò)表達(dá) TET1的 MDA-MB-231細(xì)胞模型，SYBR Green法實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TET1表達(dá)，結(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)模型中，與陰性對(duì)照組（MDA-MB-231-NC）相比，MDA-MB-231-TET1細(xì)胞中TET1上調(diào)3.11±4.61倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Western blot檢測(cè)TET1表達(dá)，應(yīng)用 Image J掃描灰度值，結(jié)果顯示，與陰

7、性對(duì)照組（ MDA-MB-231-NC）相比， MDA-MB-231-TET1細(xì)胞中 TET1上調(diào)2.67±1.55倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，空白對(duì)照組（MDA-MB-231）及陰性對(duì)照組（MDA-MB-231-NC）之間，細(xì)胞增殖未見(jiàn)明顯差異（P>0.05），而 MDA-MB-231-TET1細(xì)胞增殖能力較前兩組明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　3流式細(xì)

8、胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組（MDA-MB-231-NC）相比，MDA-MB-231-TET1細(xì)胞G2/M期比例增加（MDA-MB-231-TET113.24±3.64％vs MDA-MB-231-NC4.30±1.36%），過(guò)表達(dá)TET1誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移能力，與空白對(duì)照組（ MDA-MB-231）及陰性對(duì)照組（ MDA-MB-23

9、1-NC）相比， MDA-MB-231-TET1細(xì)胞遷移能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　5 TranswellTM小室檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲能力，與空白對(duì)照（ MDA-MB-231）及陰性對(duì)照組（ MDA-MB-231-NC）相比， MDA-MB-231-TET1細(xì)胞侵襲能力顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　6倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，過(guò)表達(dá)TET1的MDA-MB-231-TET1細(xì)胞形態(tài)

10、并未發(fā)生明顯變化，進(jìn)一步檢測(cè)EMT相關(guān)分子標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)：
　　Western blot法：與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞相比， MDA-MB-231-TET1組細(xì)胞E-cadherin表達(dá)升高（P<0.001），N-cadherin、Vimentin表達(dá)降低（P<0.05），β-catenin表達(dá)降低（P<0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　免疫熒光法：與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞相比， MDA-MB-231-TET1組細(xì)胞

11、 E-cadherin表達(dá)明顯升高， N-cadherin、Vimentin表達(dá)降低，MDA-MB-231-TET1組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核均有β-catenin表達(dá)，但相較于 MDA-MB-231-TET1組細(xì)胞，陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)升高，提示其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　7、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察荷瘤裸鼠大小，結(jié)果顯示，接種MDA-MB-231-TET1組細(xì)胞的裸鼠腫瘤大小與對(duì)照組無(wú)明顯