沉默CD147基因?qū)θ巳橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞的影響.pdf

1、背景和目的：
　　乳腺癌是女性發(fā)病率最高的腫瘤，我國(guó)發(fā)病率為50.14/10萬，且呈不斷上升趨勢(shì)。乳腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子作用下發(fā)生基因突變，癌細(xì)胞出現(xiàn)并惡性增殖使乳腺組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，擠壓并侵蝕周圍正常組織，甚至威脅生命。然而及早發(fā)現(xiàn)診斷、早期治療的患者生存率顯著提高。目前，隨著分子生物和免疫學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)乳腺癌認(rèn)識(shí)不斷深入，在其早期診斷和治療方面也取得了一定的進(jìn)展。
　　CD147是一種細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)

2、因子(EMMPRIN)，在人體細(xì)胞內(nèi)分布廣泛，涉及到不同的病理生理過程，其中主要作用是參與細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附。腫瘤組織中CD147異常激活，一方面可通過成纖維細(xì)胞刺激合成基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，另一方面可與整合素作用家族形成蛋白復(fù)合物刺激MMPs的生成，進(jìn)而降解Ⅳ型膠原，破壞細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此我們推測(cè)抑制CD147的表達(dá)可能抑制乳腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。金屬

3、基質(zhì)蛋白酶組織特異性抑制劑(the tissue inhibitor ofmetalloproteinase，TIMPs)能特異性抑制內(nèi)源性的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，其既可以與MMP-2形成復(fù)合物而使后者失活，又可以阻止MMP-2與細(xì)胞表面接觸從而抑制其活性，對(duì)其具有雙重阻滯作用。正常情況下，MMP/TIMP處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。腫瘤癌變時(shí)MMP和TIMP表達(dá)都上調(diào)，但TIMP上調(diào)程度不足以抑制MMP能力時(shí)，破壞ECM的動(dòng)態(tài)平衡，促使腫

4、瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。
　　CD147基因?yàn)槟壳把芯康臒狳c(diǎn)，但是國(guó)內(nèi)外關(guān)于利用RNA干擾靶向CD147基因研究乳腺癌的報(bào)道較少。本研究構(gòu)建CD147慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，觀察其對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移能力以及對(duì)MMP-2和TIMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，然后建立裸鼠皮下乳腺癌移植瘤模型，觀察CD147siRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞成瘤的抑制作用。以此探討CD147作為乳腺癌的治療

5、提供新的有效的靶點(diǎn)的可行性。
　　方法：
　　1.免疫組化法檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞中CD147、MMP-2、TIMP-2蛋白的表達(dá)。
　　2.病毒滴度測(cè)定，構(gòu)建CD147siRNA慢病毒載體并轉(zhuǎn)染各實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-231細(xì)胞（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、CD147siRNA轉(zhuǎn)染組），采用RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)CD147siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)CD147mRNA和蛋

6、白改變，確定最佳時(shí)間點(diǎn)。
　　3.RT-PCR和Western Blot技術(shù)分別檢測(cè)CD147siRNA轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后MMP-2、TIMP-2的mRNA和蛋白改變。
　　4.CCK-8法和劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和遷移能力的改變。
　　5.細(xì)胞懸液法建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察CD147siRNA對(duì)裸鼠瘤體體重和體積的影響。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:SPSS17.0軟件

7、處理，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)的形式表示，多組均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，顯著水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1.免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD147蛋白、MMP-2蛋白、TIMP-2蛋白主要表達(dá)于MDA-MB-231細(xì)胞的胞膜/胞質(zhì)中，呈棕黃色染色或顆粒狀陽性表達(dá)。
　　2.成功構(gòu)建CD147siRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞后，CD147siRNA轉(zhuǎn)染組中C

8、D147mRNA和蛋白的表達(dá)量均下降，且具有時(shí)間依賴性，在72h時(shí)抑制率最高。
　　3.轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞72h后，CD147siRNA轉(zhuǎn)染組中MMP-2mRNA和蛋白的表達(dá)量也均下降;TIMP-2蛋白表達(dá)量下降，但其mRNA水平與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.CCK-8試驗(yàn)顯示慢病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞2d、3d、4d后，各組間細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，與對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<