羅勒多糖對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系侵襲性的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　研究背景:基質(zhì)金屬蛋白酶在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用，其合成和分泌失衡有助于腫瘤細(xì)胞水解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)和加速轉(zhuǎn)移的發(fā)生。乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年升高，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其最主要的死亡原因，而常規(guī)的放化療手段作用有限且都不可避免的伴隨有正常組織的損傷，因此尋找能有效的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的天然藥物是提高乳腺癌患者生存質(zhì)量的重要手段。我國傳統(tǒng)的中草藥在抗腫瘤方面療效持久且副作用小，越來越

2、受到醫(yī)學(xué)界的重視。羅勒多糖是從香料族全草植物羅勒中提取的藥物有效成分，我實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)其對卵巢癌和肺癌均有一定的抑制作用，但是羅勒多糖能否抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲及是否通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶來抑制侵襲尚無相關(guān)研究。因此該研究的目的包括以下幾點(diǎn):①觀察羅勒多糖對乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的侵襲性有無影響。②研究常見的與腫瘤侵襲有關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶:基質(zhì)金屬蛋白酶2、9及膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)及羅勒多糖

3、對它們的影響。③探討羅勒多糖通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶來影響MDA-MB-231細(xì)胞侵襲性的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.體外培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，通過MTT試驗(yàn)確定羅勒多糖對其存活率的影響，以明確下一步試驗(yàn)所用羅勒多糖的濃度將100μLMDA-MB-231細(xì)胞懸液（約2×103個(gè)）接種到96孔板里培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，對照組細(xì)胞補(bǔ)加100μL RPMI1640培養(yǎng)基，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加入100μL羅勒多糖溶液（濃

4、度分別為100、200、300、400、500μg/mL）。處理20 h后，每孔分別加入15μL MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清，每孔加入150μL DMSO，振蕩溶解。然后用ELISAplate reader測540 nm光吸光度，校正波長為630 nm。用下而的公式計(jì)算細(xì)胞的存活率:細(xì)胞存活率(％)=（實(shí)驗(yàn)孔的平均吸光度/對照孔的平均吸光度）×100％。在不影響MDA-MB-231細(xì)胞存活率的羅勒多糖濃度范圍內(nèi)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

5、　　2.在不影響細(xì)胞存活率的濃度范圍內(nèi)，通過Transwell小室觀察羅勒多糖對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲性的影響體外培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞生長至70％～80％融合，棄去原培養(yǎng)液，改用無血清培養(yǎng)基饑餓12h。棄去無血清培養(yǎng)基，對照組用RPMI1640培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的羅勒多糖溶液處理20 h。用transwell小室檢測處理后的對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲性的變化。將BD Matrigel TM Matrix（15

6、μg/filter）鋪在無聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯濾膜上形成孔徑為8μm的濾膜。下室加入NIH3T3細(xì)胞的無血清培養(yǎng)上清。上室加入200μL約含有2×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。孵育10h后用棉簽擦掉濾膜上面的細(xì)胞。濾膜下面的細(xì)胞用甲醇固定，再進(jìn)行HE染色。倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選取9個(gè)視野計(jì)數(shù)。
　　3.RT-PCR法檢測羅勒多糖對基質(zhì)金屬蛋白酶2、9及膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1基因表達(dá)的影響將MDA-MB-231細(xì)胞接種到6孔板并培養(yǎng)到8

7、0％融合，將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓12h，對照組用RPMI1640培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的羅勒多糖溶液處理20 h。收集細(xì)胞，Trizol提取總RNA，應(yīng)用紫外線分光光度儀計(jì)算RNA濃度和純度。DNAase處理總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。取0.8μl cDNA作為模板PCR擴(kuò)增MT1-MMP、MMP-2、MMP-9。同時(shí)擴(kuò)增β-actin做內(nèi)參對照。比較羅勒多糖作用前后上述三種基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA水平的變化，從中篩選出有

8、變化的指標(biāo)，進(jìn)行下一步研究。
　　4.酶聯(lián)免疫吸附法檢測羅勒多糖對基質(zhì)金屬蛋白酶2、9分泌的影響將MDA-MB-231細(xì)胞接種到6孔板并培養(yǎng)到80％融合，將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓12h后，對照組用RPMI1640培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的羅勒多糖溶液處理20 h。收集上清并離心。取離心后上清液并調(diào)整蛋白濃度，根據(jù)MMP-2及MMP-9ELISA試劑盒的步驟檢測二者的含量。
　　5.明膠酶譜法檢測羅勒多糖對基質(zhì)金屬蛋白

9、酶2、9活性的影響將MDA-MB-231細(xì)胞接種到6孔板并培養(yǎng)到80％融合，將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓12h，對照組用RPMI1640培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的羅勒多糖溶液處理20 h。收集上清并離心。取離心后的含有等量蛋白的上清液進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后經(jīng)洗脫、漂洗、孵育、染色及脫色后照相并用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各條帶的光密度值。
　　6.Westren blot法檢測羅勒多糖對MT1-MMP蛋白表達(dá)的影響MDA-MB-231

10、細(xì)胞培養(yǎng)至80％融合。饑餓12h后對照組用RPMI1640培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的羅勒多糖溶液處理。20 h后收集細(xì)胞并提取蛋白。用BCA蛋白分析儀測定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行10％ SDS-PAGE電泳，之后轉(zhuǎn)膜。將膜用脫脂奶粉封閉后，加入MT1-MMP兔抗人一抗（濃度1∶1000）4℃過夜，TBST洗三次后加入小鼠抗兔二抗（濃度1∶2000），室溫孵育1h。ECL法(AmershamBioscience，Buckingham

11、shire，UK)顯像，應(yīng)用Gel-Pro軟件定量分析。
　　結(jié)果:
　　1.羅勒多糖濃度不超過300μ g/mL時(shí)MDA-MB-231細(xì)胞的存活率不受影響采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測羅勒多糖是否影響MDA-MB-231細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示，與對照組相比，羅勒多糖濃度為100、200、300μg/mL時(shí)，MDA-MB-231細(xì)胞的存活率分別為0.941、0.952和0.927，與對照組相比均沒有顯著差異（P＞0.05）。而羅勒多糖濃

12、度為400、500μg/mL時(shí)則會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，細(xì)胞存活率分別為0.650、0.568，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，為避免藥物濃度過高產(chǎn)生的細(xì)胞毒性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們使用濃度為100μg/mL和300μg/mL的羅勒多糖進(jìn)行。
　　2.羅勒多糖可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力采用transwell小室檢測對照組和實(shí)驗(yàn)組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲性的變化，結(jié)果顯示對照組穿過人工基底

13、膜的細(xì)胞數(shù)為205，而100μg/mL和300μg/mL羅勒多糖組穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為55和40?？梢娫诓划a(chǎn)生細(xì)胞毒性的藥物濃度范圍內(nèi)，羅勒多糖處理過的MDA-MB-231細(xì)胞穿透人工基底膜的能力明顯下降，且下降的程度與羅勒多糖的濃度成正比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.羅勒多糖可下調(diào)MT1-MMP基因mRNA表達(dá)水平，但對MMP-2、MMP-9的基因表達(dá)無影響采用RT-PCR檢測不同處理組MDA-MB-231細(xì)

14、胞三種基質(zhì)金屬蛋白酶:MMP-2、MMP-9及MT1-MMP的基因表達(dá)水平的變化。通過電泳條帶觀察羅勒多糖對MDA-MB-231細(xì)胞MT1-MMP及MMP-9的mRNA表達(dá)均有抑制作用，但是對MMP-2的mRNA表達(dá)無影響。進(jìn)一步定量分析顯示MDA-MB-231細(xì)胞株本身MMP-9的mRNA表達(dá)水平極低且與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。而與對照組相比，羅勒多糖處理組MT1-MMP的mRNA表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05)。

15、r>　　4.羅勒多糖對MMP-2、MMP-9的分泌量無影響用酶聯(lián)免疫吸附法檢測培養(yǎng)上清中MMP-2及MMP-9的含量，從而判斷羅勒多糖對二者的分泌有無影響。結(jié)果表明對照組及100μg/mL和300μg/mL羅勒多糖組上清液中MMP-2的濃度分別為0.2574 pg/ml、0.2468 pg/ml及0.2653pg/ml， MMP-9的濃度分別為0.1927 pg/ml、0.2137 pg/ml及0.1849 pg/ml實(shí)驗(yàn)組與對照組相比

16、均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.羅勒多糖對MMP-2、MMP-9的酶活性無影響采用明膠酶譜法檢測不同處理組MDA-MB-231細(xì)胞MMP-2及MMP-9酶活性的變化。通過電泳條帶觀察，與對照組相比羅勒多糖對MDA-MB-231細(xì)胞MMP-2及MMP-9活性無影響，進(jìn)一步定量分析顯示實(shí)驗(yàn)組和對照組MMP-2及MMP-9的活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　6.羅勒多糖可以抑制MT1-MMP的蛋白表達(dá)收集對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞并裂解，

17、提取蛋白，應(yīng)用Western Blotting檢測MT1-MMP的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示羅勒多糖處理組MDA-MB-231細(xì)胞的MT1-MMP表達(dá)水平下調(diào)，且下調(diào)程度與處理時(shí)所用羅勒多糖的濃度成正比。
　　結(jié)論:
　　1.羅勒多糖有抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲性的作用。
　　2.生理情況下MMP-2、MMP-9及MT1-MMP在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中均有表達(dá)，其中MMP-9的表達(dá)水平較低。