TREM-2在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 TREM-2在膿毒癥小鼠中的表達(dá)及其與膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系
　　研究目的:TREM-2是一類主要表達(dá)于活化的巨噬細(xì)胞、屬于免疫球蛋白超家族的細(xì)胞表面受體。Ⅱ型細(xì)胞因子（如IL-4等）能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TREM-2的表達(dá)。TREM-2是包括G+菌、G-菌和酵母菌等在內(nèi)的病原微生物的吞噬受體，TREM-2及其介導(dǎo)的信號通路能明顯減弱巨噬細(xì)胞產(chǎn)生與釋放促炎介質(zhì)的能力。因而推測TREM-2可能在膿毒癥的感染和免疫炎癥調(diào)控過程中發(fā)揮重

2、要作用。因此，本部分研究通過檢測膿毒癥小鼠重要臟器/組織巨噬細(xì)胞TREM-2的表達(dá)水平，分析細(xì)胞TREM-2的表達(dá)水平和膿毒癥發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān)性。
　　研究方法:采用CLP誘導(dǎo)小鼠膿毒癥模型，以假手術(shù)小鼠作為對照組，于術(shù)后0h、6h、12h、24h、72h、120h、168h取小鼠肝臟、肺臟、脾臟和腹腔灌洗液、外周血等。采用免疫組化法檢測肝臟、肺臟和脾臟組織中TREM-2的表達(dá)水平，并采用雙重免疫熒光標(biāo)記法對TREM-2的表達(dá)進(jìn)

3、行細(xì)胞定位。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腹腔巨噬細(xì)胞中TREM-2的表達(dá)水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linkedimmunosorbent assay, ELISA）檢測外周血IL-4、IL-13和IL-10濃度，采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測腹腔細(xì)菌感染程度。
　　結(jié)果:膿毒癥小鼠和對照小鼠術(shù)后0h各臟器組織均不表達(dá)TREM-2。在肝臟、肺臟和脾臟，膿毒癥小鼠CLP術(shù)后6h TREM-2表達(dá)水平開始增強(qiáng)，并于術(shù)后72h到達(dá)峰值，之后又

4、呈逐漸下降，而對照組小鼠在各時間點(diǎn)均未檢測到TREM-2表達(dá)。雙重免疫熒光標(biāo)記法證實(shí)TREM-2表達(dá)于組織巨噬細(xì)胞。在腹腔巨噬細(xì)胞中，膿毒癥小鼠TREM-2的表達(dá)變化與其他臟器一致，而對照組小鼠在術(shù)后24h TREM-2表達(dá)水平稍有增加，兩組小鼠TREM-2表達(dá)水平在術(shù)后72h時有顯著性差異（P＜0.05）。膿毒癥小鼠血漿IL-4濃度在CLP術(shù)后24h達(dá)峰值，其動態(tài)變化趨勢與TREM-2的表達(dá)變化相似，但要早于TREM-2。膿毒癥小鼠腹

5、腔細(xì)菌感染在CLP術(shù)后逐漸增加，于術(shù)后72h感染最嚴(yán)重，其動態(tài)變化與TREM-2的表達(dá)變化完全一致。但TREM-2的表達(dá)變化與血漿IL-13和IL-10的濃度變化無關(guān)。
　　結(jié)論:在膿毒癥小鼠中，TREM-2的表達(dá)水平呈先增強(qiáng)后減弱的變化特征，于膿毒癥72h后達(dá)峰值。TREM-2的表達(dá)變化可能與IL-4的誘導(dǎo)性有關(guān)，而且可能在膿毒癥感染的免疫防御中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分阻斷TREM-2對膿毒癥發(fā)病的影響
　　研究

6、目的:鑒于TREM-2在膿毒癥發(fā)病過程中的表達(dá)變化特征，因此本部分研究主要探討阻斷內(nèi)源性TREM-2的作用對膿毒癥發(fā)病的影響及機(jī)制。
　　研究方法:將CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠，隨機(jī)分為兩組，在CLP18h后，通過尾靜脈注射的方法分別給予20μg小鼠TREM-2/人IgG1重組蛋白（mTREM-2/IgG1組）和20μg人IgG1重組蛋白（IgG1組），觀察其7天生存率。同時，分別于給予重組蛋白24h、72h和120h后，取腹腔灌洗液

7、和外周血，采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測腹腔細(xì)菌感染程度，采用ELISA法檢測腹腔灌洗液和外周血IL-10濃度。
　　結(jié)果:與IgG1組相比，mTREM-2/IgG1組小鼠7天生存率顯著降低(8.3％vs.50％;P＜0.05)。給予重組蛋白24h后，兩組小鼠腹腔細(xì)菌感染程度無顯著性差異（P＞0.05）;給予重組蛋白72h和120h后，mTREM-2/IgG1組小鼠腹腔細(xì)菌感染均較IgG1組小鼠明顯加重(P＜0.05)。兩組小鼠腹腔灌洗液

8、和外周血IL-10濃度無顯著性差異。
　　結(jié)論:阻斷TREM-2的作用降低膿毒癥小鼠的7天生存率，其原因可能與加重膿毒癥小鼠的細(xì)菌感染有關(guān)。
　　第三部分重組TREM-2對膿毒癥的保護(hù)作用研究
　　研究目的:鑒于TREM-2在膿毒癥中呈誘導(dǎo)性表達(dá)，且其表達(dá)峰值較遲，而阻斷TREM-2的作用則加重膿毒癥的發(fā)病，因此本部分研究主要探討在膿毒癥發(fā)病早期重組TREM-2對膿毒癥的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　研究方法:構(gòu)建表達(dá)

9、TREM-2的重組腺病毒和對照腺病毒，分別感染BMMC，用Western-blot和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測TREM-2蛋白的表達(dá)水平。以高表達(dá)TREM-2的BMMC為研究對象，一方面采用激動性抗體激活TREM-2介導(dǎo)的信號通路，并用100 ng/ml脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激，觀察重組TREM-2對炎癥反應(yīng)的影響;另一方面觀察高表達(dá)TREM-2的BMMC對熒光顆粒和細(xì)菌的吞噬功能。將高表達(dá)TREM-2的BMM

10、C于膿毒癥模型誘導(dǎo)后不同時間點(diǎn)(2h、4h、6h)回輸至小鼠體內(nèi)，觀察重組TREM-2對膿毒癥小鼠7天生存率的影響。在膿毒癥后2h細(xì)胞回輸組，于細(xì)胞回輸后24h和48h分別取小鼠外周血、腹腔灌洗液、肝臟、肺臟和脾臟等。采用瓊脂平板培養(yǎng)法檢測全身和局部細(xì)菌感染程度，采用ELISA法檢測炎癥因子IL-10濃度，采用組織化學(xué)法等觀察臟器形態(tài)功能。
　　結(jié)果:重組腺病毒能在BMMC中高表達(dá)TREM-2。激活BMMC中的TREM-2分子，能

11、活化其下游的Akt信號分子，經(jīng)LPS刺激后，顯著增強(qiáng)IL-10 mRNA水平。高表達(dá)TREM-2的BMMC對熒光顆粒和細(xì)菌均有顯著增強(qiáng)的吞噬作用。膿毒癥模型誘導(dǎo)后2h和4h回輸高表達(dá)TREM-2的BMMC能明天改善小鼠的7天生存率。在膿毒癥后2h細(xì)胞回輸組，細(xì)胞回輸24h和48h后小鼠全身和局部細(xì)菌負(fù)荷量明顯下降，肝臟和肺臟損傷明顯減輕，脾臟細(xì)胞凋亡減少，但外周血和腹腔灌洗液中IL-10水平無顯著變化。
　　結(jié)論:膿毒癥發(fā)病早期增