Reg Ⅳ和miR-24在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制.pdf

1、目的：研究Reg IV基因在胃癌中的表達情況及其與臨床病理特征之間的相關(guān)性；探索Reg IV基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的調(diào)控機制。 方法：運用實時定量PCR的方法檢測了48例胃癌病人腫瘤組織及相配對的正常胃粘膜組織中的Reg IV的表達情況，并與臨床病理特征相聯(lián)系，了解其相關(guān)性；運用免疫組化的方法檢測了18例胃癌病人腫瘤組織及相配對的正常胃粘膜組織中的Reg IV蛋白的表達定位情況。同時，實時定量PCR的方法比較胃癌細胞株

2、與永生化胃粘膜細胞株之間Reg IV的表達差異，挑選Reg IV高表達細胞株，運用RNAi的方法下調(diào)Reg IV的表達，觀察Reg IV表達下調(diào)后胃癌細胞生物學(xué)行為的改變，包括細胞增殖能力、凋亡情況以及遷移侵襲能力等。利用互聯(lián)網(wǎng)microRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-24調(diào)控Reg IV的表達，檢測胃癌組織及胃癌細胞株中miR-24的表達情況，分析miR-24和Reg IV在胃癌組織中的表達相關(guān)性；將miR-24和miR-24反義寡核苷酸

3、分別轉(zhuǎn)染SNU-16和BGC-823胃癌細胞株，通過實時定量PCR 以及ELISA檢測轉(zhuǎn)染后Reg IV的表達情況的變化，同時檢測了轉(zhuǎn)染后胃癌細胞生物學(xué)行為的變化。 結(jié)果：實時定量PCR檢測結(jié)果顯示在48例胃癌病人腫瘤組織中有28（58.3％）例Reg IV基因高表達，RegIV的表達與胃癌的分化程度、組織分型、侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床病理因素無相關(guān)性。免疫組化檢測結(jié)果顯示Reg IV在正常胃粘膜中表達陰性，在腸化

4、生的胃粘膜組織中表達呈弱陽性，而在胃印戒細胞癌中表達呈強陽性。與永生化胃黏膜細胞株GES-1相比，除了MKN-45和SNU-1以外，各胃癌細胞株中Reg IV的表達水平均升高5倍以上，特別是SNU-16細胞，RegIV的表達水平比GES-1升高7120.333倍，遂用SNU-16細胞株做RNAi 以及體外功能實驗。用針對Reg IV的siRNA1進行RNAi實驗，24h后SNU-16細胞在mRNA水平RegIV的抑制效率為79.3％，4

5、8小時后用ELISA檢測轉(zhuǎn)染后的SNU-16細胞培養(yǎng)液上清發(fā)現(xiàn)在蛋白水平同樣觀察到Reg IV表達受到抑制。Reg IV表達受到抑制后SNU-16細胞的增殖能力、遷移及侵襲能力明顯降低，而細胞凋亡率增加。實時定量PCR檢測37例胃癌病人腫瘤組織中miR-24的表達，發(fā)現(xiàn)有17例（45.9％）低表達，miR-24表達情況與胃癌的浸潤深度有關(guān)，與分化程度、組織分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期等臨床病理特征無關(guān)。在9 株胃癌細胞株中SNU-16

6、的miR-24的表達量最低，BGC-823的表達量最高，于是選用這兩株細胞株進行后續(xù)的miR-24的上調(diào)和下調(diào)實驗。將miR-24以及miR-24反義寡核苷酸分別轉(zhuǎn)染SNU-16和BGC-823細胞株中，24h后Reg IV mRNA水平變化不明顯；而48小時后ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，SNU-16細胞培養(yǎng)液上清中Reg IV蛋白水平明顯降低，而BGC-823細胞上清中Reg IV蛋白水平明顯升高，表明miR-24 對Reg

7、 IV基因的翻譯具有調(diào)控作用。體外功能學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)SNU-16細胞轉(zhuǎn)染miR-24 后，細胞的增殖能力、遷移及侵襲能力明顯降低，而細胞凋亡率增加；而BGC-823細胞轉(zhuǎn)染miR-24反義寡核苷酸后，細胞的增殖能力、遷移及侵襲能力明顯增強，而細胞凋亡率則顯著下降。 結(jié)論：①Reg IV在胃癌組織中表達上調(diào)，但與胃癌的分化程度、組織分型、侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期等臨床病理因素無關(guān)；②Reg IV基因在胃癌中起到了促增殖、抗凋