胃癌細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜的建立及miR-29c在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、【研究背景和目的】胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤前列，在我國居消化道惡性腫瘤發(fā)病率的首位。胃癌的早期診斷和治療一直是臨床難點(diǎn)所在，尤其是中晚期無法手術(shù)及伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。因此，深入研究胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制有助于更好地診斷和治療。
　　microRNA（miRNA或miR）是一類真核生物內(nèi)源性的具有重要調(diào)節(jié)作用的小分子單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞的生長、分化、凋亡等生命活動。

2、研究表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等病理進(jìn)程密切相關(guān)，miRNA可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　為此，本研究收集胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜細(xì)胞，通過miRNA寡核苷酸芯片技術(shù)，篩選胃癌可能相關(guān)的差異miRNAs，建立胃癌細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜。進(jìn)一步采用實(shí)時熒光定量PCR（Q-PCR）方法對差異miRNAs進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，以期發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞和胃癌組織中表達(dá)相一致的胃癌相關(guān)miRNAs，作為候選的在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中起重

3、要作用的miRNAs，以便進(jìn)一步研究其在胃癌進(jìn)程中的影響。
　　【材料與方法】收集9株胃癌細(xì)胞和6例正常胃黏膜細(xì)胞，抽提總RNA，采用miRNA寡核苷酸芯片，檢測胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜中的miRNAs表達(dá)譜，比較并篩選出具有顯著差異的miRNAs。采用Q-PCR方法驗(yàn)證由芯片篩選出的差異miRNAs在胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜中的表達(dá)情況，并收集40對胃癌組織樣本檢測這些差異miRNAs的表達(dá)。篩選出在胃癌細(xì)胞和胃癌組織中表達(dá)相一致的胃癌

4、相關(guān)miRNAs，其中包括miR-29c。采用miR-29c precursor或miR-29c逆轉(zhuǎn)錄病毒過表達(dá)載體上調(diào)胃癌細(xì)胞SGC-7901中miR-29c的表達(dá)水平，觀察其過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力和裸鼠皮下腫瘤生長能力等生物學(xué)行為的影響來研究miR-29c在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。并利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-29c的靶基因，結(jié)合雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)、Q-PCR和Western blot檢測方法，驗(yàn)證NASP為miR

5、-29c的靶基因，初步明確miR-29c發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)制。
　　【結(jié)果】在miRNA寡核苷酸芯片篩選的566個人類miRNAs中，通過比較胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜中miRNAs的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)46個miRNAs有顯著差異，其中17個miRNAs顯著上調(diào)（LogRatio>1.0），29個miRNAs顯著下調(diào)（LogRatio<-5.0）。利用這46個差異miRNAs進(jìn)行聚類分析，能較好地將胃癌細(xì)胞和正常胃黏膜區(qū)分開來。由于引物商

6、品化等原因，我們合成了41個miRNAs的引物（其中包括15個上調(diào)的miRNAs和26個下調(diào)的miRNAs），進(jìn)入下一步的Q-PCR驗(yàn)證。
　　比較上述miRNAs在9株胃癌細(xì)胞和6例正常胃黏膜及40對胃癌組織和配對癌旁組織中的表達(dá)情況，15個上調(diào)的miRNAs在胃癌細(xì)胞和胃癌組織中的表達(dá)情況與芯片結(jié)果的符合率分別為73.33％（11/15）和66.67%（10/15），26個下調(diào)的miRNAs分別為88.46%（23/26）和3

7、0.77%（8/26）。綜合以上結(jié)果，我們篩選出15個與胃癌相關(guān)的miRNAs，其中有8個上調(diào)，分別為miR-196a，miR-196b，miR-18a*，miR-183，miR-18a，miR-106a，miR-186和 miR-93；7個下調(diào)，分別為 miR-451，miR-495，miR-409-3p，miR-497，miR-133b，miR-136和miR-29c。
　　以上15個miRNAs作為胃癌相關(guān)miRNAs，可能

8、在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起相當(dāng)重要的作用。在此課題中，我們主要關(guān)注了miR-29c在胃癌中的生物學(xué)功能。研究表明，上調(diào)miR-29c的表達(dá)水平能有效抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901體外增殖、克隆形成及遷移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá) miR-29c能抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901裸鼠皮下腫瘤生長能力。
　　生物信息學(xué)分析提示NASP3’UTR含有miR-29c作用的靶序列，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測進(jìn)一步驗(yàn)證了NASP是mi

9、R-29c的直接靶基因，Q-PCR及Western blot證實(shí)miR-29c對NASP表達(dá)的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。
　　【結(jié)論】miRNA寡核苷酸芯片篩選出的差異miRNAs構(gòu)成的miRNAs表達(dá)譜能將胃癌細(xì)胞與正常胃黏膜較好地區(qū)分開來。miR-29c在胃癌細(xì)胞和胃癌組織中顯著下調(diào)，能抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901體外增殖、克隆形成及遷移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)miR-29c能抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901裸鼠皮下