miR-200c在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的：檢測(cè)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine-inducedkillercells，CIK）的主要效應(yīng)細(xì)胞（CD3+CD56+T細(xì)胞）對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及miR-200c表達(dá)的影響，探討miR-200c在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡中的作用。
　　方法：1.外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞后加入IFN-γ（1000U/mL）培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入anti-CD3（5μg/mL）和IL-2（700U/mL），每2~3天補(bǔ)加IL-2繼續(xù)培養(yǎng)1

2、4天。磁珠分選后的CD3+CD56+CIK細(xì)胞和胃癌細(xì)胞（MKN-45和BGC-803）以不同比例（5：1、10：1、20：1、40：1）培養(yǎng)不同時(shí)間（0、6、12、24小時(shí)）后WST法檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖，確定最適效靶比及最佳作用時(shí)間。
　　2.胃癌細(xì)胞分為對(duì)照、CIK組，培養(yǎng)12小時(shí)后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞凋亡，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)miR-200c表達(dá)；胃癌細(xì)胞分為對(duì)照、miR-CTL、miR-200cmimics組，同時(shí)

3、分為對(duì)照、miR-200cinhibitor、CIK、CIK+miR-200cinhibitor組，培養(yǎng)12h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡。
　　3.構(gòu)建包含miR-200c作用位點(diǎn)的psiCHECK2-FAP-13'-UTR，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞48h后加入CIK細(xì)胞，培養(yǎng)12小時(shí)后雙熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。胃癌細(xì)胞分為對(duì)照、miR-CTL、miR-200cmimics組，同時(shí)分為對(duì)照、miR-200cinhibitor、CIK、CIK+

4、miR-200cinhibitor組，培養(yǎng)12h后westernblot檢測(cè)FAP-1表達(dá)。
　　4.胃癌細(xì)胞分為對(duì)照、CIK組，RT-PCR和Westernblot分別檢測(cè)CIK細(xì)胞作用后胃癌細(xì)胞FAP-1基因及蛋白表達(dá)。胃癌細(xì)胞分為對(duì)照、CIK、CIK+FAP-1-siRNA，培養(yǎng)后12小時(shí)后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：1.CD3+CD56+CIK細(xì)胞比例培養(yǎng)14天后由（1.29％±0.37%）上升為（32.

5、3%±3.76%（P<0.01），純度為92.34%。CIK細(xì)胞以時(shí)間、濃度依賴方式殺傷胃癌細(xì)胞，在12小時(shí)（P<0.05）和效靶比20：1時(shí)（P<0.05）作用顯著。2.與對(duì)照組（MKN-45：3.56%±0.81%，BGC-803：2.70%±0.71%）相比，CIK作用后胃癌細(xì)胞凋亡率顯著升高（MKN-45：22.08%±2.10%，P<0.05；BGC-803：21.28%±2.21%，P<0.05），miR-200c表達(dá)升高（

6、MKN45細(xì)胞：2.10±0.25倍，P<0.05；BGC-803細(xì)胞：1.87±0.11倍，P<0.05），miR-200cmimics能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡（P<0.05），而miR-200cinhibitor能夠拮抗CIK細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用（MKN45細(xì)胞：40.11%±6.56%，BGC-803細(xì)胞：61.73%±5.27%）。3.miR-200c直接作用于FAP-1基因3'-UTR區(qū)，與對(duì)照組相比，CIK細(xì)胞降低胃癌細(xì)胞

7、熒光素酶活性（MKN-45細(xì)胞：49.67%±2.36%，P<0.01；BGC-803細(xì)胞：43.86%±4.41%，P<0.01）。miR-200cmimics抑制胃癌細(xì)胞FAP-1表達(dá)（P<0.05），而miR-200cinhibitor能夠拮抗CIK細(xì)胞對(duì)FAP-1下調(diào)作用（P<0.05）。
　　4.與對(duì)照組相比，CIK細(xì)胞下調(diào)胃癌細(xì)胞FAP-1基因（MKN-45：58.59%±1.23%，BGC-803：65.39%±1.

8、57%）及蛋白（MKN-45：46.86%±1.16%；BGC-803：45.38%±6.48%）表達(dá)，CIK細(xì)胞通過(guò)抑制FAP-1（P<0.05）促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡（P<0.01）。
　　結(jié)論：1.CIK細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞具有抗增殖及誘導(dǎo)凋亡作用。
　　2.CIK細(xì)胞通過(guò)上調(diào)胃癌細(xì)胞的miR-200c表達(dá)，作用于靶基因FAP-1的3'-UTR，抑制FAP-1表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。
　　3.CIK細(xì)胞是一種能夠?qū)ξ赴┘?xì)胞具