胃癌細(xì)胞MGC803中miR-200a作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、前言
　　 胃癌是源自胃粘膜上皮的惡性腫瘤,在我國(guó)發(fā)病率及死亡率很高。胃癌涉及到多種癌基因的激活及抑癌基因的失活,揭示這些基因變化的規(guī)律,不僅可以闡明癌變的機(jī)制,更可以協(xié)助腫瘤的診斷、治療和預(yù)后。近年來(lái),miRNA分子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作為腫瘤發(fā)生發(fā)展的又一可能因?yàn)?受到越來(lái)越多的關(guān)注。
　　 MicroRNAs是長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的小RNA分子,在真核生物中發(fā)揮基因表達(dá)調(diào)控作用,通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá),參與腫瘤的

2、發(fā)生發(fā)展。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期利用多重連接依賴式探針擴(kuò)增(Multiplex Ligation-dependentProbe Amplification,MLPA)技術(shù)對(duì)50例胃癌組織進(jìn)行基因組水平的分析,發(fā)現(xiàn)有58％的病例存在染色體1p36區(qū)域的缺失,提示該區(qū)域可能存在胃癌特異性的抑制基因或調(diào)控序列。人類miR-200a定位于染色體1p36區(qū),在乳腺癌、卵巢癌及結(jié)腸癌細(xì)胞中已證實(shí)miR-200a通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子ZEB2的表達(dá),

3、間接調(diào)節(jié)E-cadherin的表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞的遷移,抑制上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial to mesenchymaltransition,EMT),但在胃癌中miR-200a的作用及可能的作用途徑尚不清楚。E-cadherin是細(xì)胞粘附分子cadherin家族成員,對(duì)于上皮的形成和維持具有重要作用,其功能缺失與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。有研究表明:E-cad]herin參與調(diào)控EphA2與其配體的結(jié)合及后續(xù)降解,EphA2的功能活

4、化也依賴于適當(dāng)?shù)腅-cadherin蛋白表達(dá)及功能定位。EphA2在許多腫瘤組織中呈過(guò)度表達(dá),尤其高表達(dá)于高侵襲性的腫瘤細(xì)胞。新近研究發(fā)現(xiàn)EphA2在胃癌組織中高表達(dá),且與胃癌的侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　 本研究以胃癌MGC803細(xì)胞為研究對(duì)象,試圖探討胃癌中miR-200a的作用及可能參與的信號(hào)途徑,以期為胃癌發(fā)生發(fā)展的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料與方法
　　 1、化學(xué)合成的miR-200a及相應(yīng)陰性對(duì)

5、照(Negative control,NC)mimics
　　 miR-200a:5’-UAACACUGUCUGGUAACGAUG U-3’;
　　 Negative control:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’
　　 2、miR-200a及NC轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞,使miR-200a過(guò)表達(dá),應(yīng)用steam-100p RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后表達(dá)效率。
　　 3、轉(zhuǎn)染miRNA m

6、imics 24及48h,利用TRIzol法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)ZEB2、E-cadherin、EphA2的mRNA表達(dá)。
　　 4、轉(zhuǎn)染miRNA mimics 24及48h,應(yīng)用western blot方法檢測(cè)E-cadherin、EphA2的蛋白表達(dá)。
　　 5、應(yīng)用MG132阻斷蛋白降解,分析miR-200a對(duì)EphA2降解的調(diào)節(jié)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　

7、1、miR-200a及NC mimics轉(zhuǎn)染后表達(dá)效率的檢測(cè)
　　 經(jīng)steam-100p RT-PCR檢測(cè),轉(zhuǎn)染miR-200a組中miR-200a的表達(dá)為轉(zhuǎn)染NC組的1838±5.3倍,表明miRNA片段轉(zhuǎn)染后成功高效表達(dá)。
　　 2、胃癌細(xì)胞MGC803中miR-200a對(duì)ZEB2表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　 MGC803細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200a 24 h,轉(zhuǎn)染miR-200a組ZEB2的表達(dá)量為對(duì)照組的0.7倍；轉(zhuǎn)染

8、后48 h,轉(zhuǎn)染miR-200a組ZEB2的表達(dá)量為對(duì)照組的0.71倍。
　　 3、胃癌細(xì)胞MGC803中miR-200a對(duì)E-cadherin表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　 MGC803細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200a 24及48h,轉(zhuǎn)染miR-200a組E-cadherin表達(dá)均高于對(duì)照組。在RNA水平,實(shí)驗(yàn)組E-cadherin表達(dá)量約為對(duì)照組的2.381、6.337倍；在蛋白水平,實(shí)驗(yàn)組E-cadherin表達(dá)量約為對(duì)照組的1.57、

9、5.43倍。
　　 4、胃癌細(xì)胞MGC803中miR-200a對(duì)EphA2表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　 MGC803細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-200a 24h后,轉(zhuǎn)染miR-200a組Epha2表達(dá)明顯高于對(duì)照組。在RNA水平,實(shí)驗(yàn)組EphA2表達(dá)量約為對(duì)照組的4.78倍；在蛋白水平,實(shí)驗(yàn)組EphA2表達(dá)量約為對(duì)照組的3.4倍。而48h后轉(zhuǎn)染miR-200a組EphA2表達(dá)略高于對(duì)照組。在RNA水平,實(shí)驗(yàn)組EphA2表達(dá)量約為對(duì)照組的1.39

10、倍。在蛋白水平,實(shí)驗(yàn)組EphA2表達(dá)量約為對(duì)照組的1.12倍。
　　 5、miR-200a可部分抵消MG132介導(dǎo)的EphA2降解抑制
　　 蛋白酶體抑制劑MG132可明顯抑制EphA2的降解,轉(zhuǎn)染NC的MG132處理組EphA2的表達(dá)量約為對(duì)照組的2.83倍；而轉(zhuǎn)染miR-200a后,未見(jiàn)EphA2明顯的降解抑制,MG132的作用被部分抵消,使得MG132處理組EphA2的表達(dá)量約為對(duì)照組的0.93倍。