DADS誘導人胃癌MGC803細胞相關基因差異表達分析.pdf

1、目的:研究二烯丙基二硫(Diallyl disulfide, DADS)誘導人胃癌細胞差異表達基因,繪制其差異基因表達圖譜,尋找 DADS作用人胃癌細胞的候選相關基因,為揭示DADS抗胃癌機制,開拓人胃癌防治的新途經奠定基礎。
　　方法:體外培養(yǎng)人胃癌MGC803細胞,倒置顯微鏡和光鏡觀察DADS處理MGC803細胞形態(tài)的改變;MTT比色法檢測不同濃度DADS對MGC803細胞增殖活性的影響;堿性磷酸酶(Alkaline Phos

2、phatase, ALP)活性檢測法觀察DADS對MGC803生化代謝的作用;抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization,SSH)、T/A克隆、測序以及生物信息學方法分析DADS誘導MGC803細胞過程中基因的差異表達。
　　結果:細胞形態(tài)學觀察:30mg/L DADS處理MGC803細胞24h后,與對照組相比,胞漿豐富,細胞核變小,染色變淡,核仁數(shù)目明顯減少,散在分布生長,部分細胞

3、變圓,浮起。
　　MTT顯示:10、20、30、40、50mg/L DADS對胃癌MGC803細胞增殖的抑制率分別為15.2％、26.2%、51.4%、57.3%、70.0%,呈濃度依賴關系。
　　ALP活性檢測:ALP比活性呈濃度依賴性下降,10、20、30、40、50mg/L處理MGC803細胞后,其下降率分別為13.7%、25.6%、49.9%、66.5%、72.0%。
　　總RNA提取和mRNA純化:提取的總R

4、NA可見明顯的28S、18S和5S的清晰無拖尾條帶,mRNA為清晰―smear‖帶,無DNA和RNA污染。
　　SSH結果:連接效率檢測,Rsa I酶消化產物 cDNA與接頭連接效率大于25%;消減有效性實驗,未消減樣品在15次循環(huán)時即可見G3PDH陽性條帶,消減產物在循環(huán)數(shù)達25-30次才見擴增產物,且產物量明顯減少;巢式PCR產物分析顯示,消減組產物片段明顯少于未消減組產物片段,前者可見清浙的條帶,后者呈瀑布狀;差異消減cDN

5、A文庫的建立及鑒定,T/A克隆后,轉化大腸桿菌JM109菌后,隨機挑取80個白色克隆,提取質粒DNA,EcoRⅠ酶切、PCR分析發(fā)現(xiàn)60個克隆具有大小約100~1000 bp的插入片段。
　　測序及生物信息學分析:測序共獲得34個序列完整的克隆。GenBank同源性比較,篩選出DADS誘導胃癌細胞前后差異表達的12個基因,序列同源性為98%-100%。正向消減文庫中,上調表達基因有細胞周期相關基因 p21WAF1、ENO1,抗氧化

6、相關基因FTH1、PRDXⅡ,細胞骨架相關基因PFN1,細胞代謝相關基因MDH2;反向消減文庫中,下調表達基因為細胞周期相關基因PTOV1,細胞骨架及細胞遷移相關基因 ANXA2、RAC1、WDR1,細胞代謝相關基因ALDOA以及癌基因EWSR1。
　　結論:
　　1.成功構建DADS誘導MGC803細胞差異表達基因的正、反向消減 cDNA文庫。
　　2.初步篩選了12個DADS誘導MGC803細胞差異表達基因,上調的