沉默LIMK1對羅格列酮抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響.pdf

1、目的：利用慢病毒介導(dǎo) LIMK1沉默的方法，觀察羅格列酮（Rosiglitazone，ROS）抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的作用。
　　方法：設(shè)計并構(gòu)建3條LIMK1沉默的shRNA載體，包裝成慢病毒，根據(jù)預(yù)試驗的轉(zhuǎn)染效率計算MOI值；采用熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印記法（western blot）分別在mRNA和蛋白水平上檢測LIMK1的沉默情況，選擇一條沉默效率最佳的shRNA-LIMK1用于后續(xù)

2、實(shí)驗；ROS分別處理人胃癌 MGC803細(xì)胞及 LIMK1沉默的 MGC803細(xì)胞后，在mRNA和蛋白水平上檢測LIMK1的表達(dá)情況。CCK-8(Cell Counting Kit-8)、平板克隆形成實(shí)驗、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室遷移、侵襲實(shí)驗觀察沉默LIMK1對ROS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了3條LIMK1-shRNA慢病毒載體并包裝成病毒。
　　設(shè)計

3、3條LIMK1 shRNA序列，分別為LV-LIMK1-RNAi(37154-1)、LV-LIMK1-RNAi(37155-1)、LV-LIMK1-RNAi(37156-1)和一條陰性對照序列 LV，并包裝成慢病毒，通過預(yù)實(shí)驗得到MGC803細(xì)胞的MOI值為50。
　　2.成功篩選出最佳LIMK1-RNAi(37156-1)干擾序列。
　　3條shRNA干擾序列LV-LIMK1-RNAi(37156-1)、(37155-1)

4、、(37154-1)對LIMK1 mRNA的抑制率分別為91.9％、75.9%、90.7%，蛋白抑制的效果分別為72.4%、29.4%、63.7%。其中陰性病毒組與未感染組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。因此，LV-LIMK1-RNAi(37156-1)沉默效果最佳。
　　3.ROS在mRNA和蛋白水平上抑制LIMK1的表達(dá)。
　　結(jié)果顯示：在MGC803細(xì)胞中，ROS能夠在 mRNA和蛋白水平上抑制LIMK1的表達(dá)（

5、P<0.05）；在LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞中，ROS能夠進(jìn)一步抑制LIMK1的表達(dá)（P<0.05）。
　　4.LIMK1沉默促進(jìn)了ROS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。
　　4.1.CCK-8實(shí)驗結(jié)果表明：在MGC803細(xì)胞中，ROS處理組細(xì)胞活力明顯低于未處理組（P<0.05）；在LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞中，LIMK1的沉默能夠降低細(xì)胞的增殖能力（P<0.05）；加入ROS處理后，LIMK1的沉

6、默組細(xì)胞活力與未沉默組相比細(xì)胞活性有顯著減少（P<0.05）。
　　4.2.平板克隆形成實(shí)驗結(jié)果提示：在MGC803細(xì)胞中，ROS處理組集落形成數(shù)明顯少于未處理組（P<0.05）；在LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞中，沉默組集落形成數(shù)較未沉默組明顯減少（P<0.05）；加入ROS處理后， LIMK1的沉默組與未沉默組比較細(xì)胞集落數(shù)有顯著性減少（P<0.05）。
　　4.3.流式細(xì)胞儀檢測周期結(jié)果顯示：在MGC803細(xì)胞中，R

7、OS處理組細(xì)胞周期發(fā)生 G1期停滯的現(xiàn)象，而相應(yīng)的 S期細(xì)胞數(shù)量則顯著減少（P<0.05）；在LIMK1沉默的MGC803細(xì)胞中，LIMK1沉默組的G1期細(xì)胞比例也明顯增加（P<0.05）；加入ROS處理后，LIMK1的沉默組與未沉默組比較G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步增加。
　　4.4.Transwell遷移實(shí)驗顯示：在MGC803細(xì)胞中，ROS處理組遷移細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05）；在 LIMK1沉默的 MGC803細(xì)胞中，LIMK1

8、沉默組遷移細(xì)胞數(shù)也明顯減少（P<0.05）；加入ROS處理后，LIMK1的沉默組與未沉默組比較遷移細(xì)胞數(shù)有顯著性減少（P<0.05）。
　　4.5.Transwell侵襲實(shí)驗顯示：在MGC803細(xì)胞中，ROS處理組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少（P<0.05）；在 LIMK1沉默的 MGC803細(xì)胞中，LIMK1沉默組穿膜細(xì)胞數(shù)也明顯減少（P<0.05）；加入ROS處理后，LIMK1的沉默組與未沉默組比較穿膜細(xì)胞數(shù)有顯著性減少（P<0.05）