RNA干擾LIMK1對DADS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞遷移與侵襲的作用.pdf

1、目的：研究證明，LIMK（Lim kinase）是調(diào)控細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的重要分子之一，在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用得到研究者廣泛的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室前期蛋白質(zhì)組學(xué)檢測二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）處理人胃癌MGC803細(xì)胞后，LIMK下降。且證明DADS可通過下調(diào)LIMK1抑制人胃癌MGC803細(xì)胞遷移侵襲，本研究旨在探討RNA干擾LIMK1對DADS抑制人胃癌MGC803細(xì)胞遷移侵襲的作用，以闡明LIMK1

2、是抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的重要分子。
　　方法：RNA干擾人胃癌MGC803細(xì)胞LIMK1，RT-PCR和Western blot檢測干擾效率；細(xì)胞劃痕和 transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測干擾 LIMK1和 DADS對人胃癌MGC803細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響；Western blot檢測Rac1、Rock1、Pak1、LIMK1、cofilin1、p-cofilin1蛋白水平表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、pcDNA6.2/

3、LIMK1-miRNA/MGC803重組細(xì)胞的構(gòu)建
　　四組pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-LIMK1干擾質(zhì)粒及陰性干擾質(zhì)粒瓊脂糖電泳跑膠呈馬蹄形，表示質(zhì)粒提取成功。將提取的5組干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入MGC803細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下可見細(xì)胞發(fā)綠色熒光。Western blot結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染LIMK1-miRNA1-4分別使MGC803細(xì)胞LIMK1蛋白表達(dá)水平下降30％、28%、72%、75%，LIMK1-m

4、iRNA4轉(zhuǎn)染組LIMK1蛋白表達(dá)抑制最明顯（P<0.05），陰性轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比之間無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，LIMK1-miRNA1、LIMK1-miRNA4組LIMK1 mRNA下降明顯。綜合Western blot和RT-PCR結(jié)果，采用LIMK1-miRNA4/MGC803細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對象。
　　2、RNA干擾LIMK1對DADS抑制MGC803細(xì)胞遷移與侵襲的影響
　　劃痕實(shí)驗(yàn)顯

5、示，24h后，干擾組劃痕距離較未干擾組、陰性干擾組增寬（P<0.05）；未干擾組與陰性干擾組無差異（P>0.05）。30mg·L-1DADS處理24h后，干擾組較未干擾組與陰性干擾組明顯增寬（P<0.05），未干擾組與陰性干擾組差異無明顯差異（P>0.05），干擾組加藥前后無意義。表明干擾LIMK1可抑制MGC803細(xì)胞遷移。
　　Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，24h后，干擾組和 DADS處理干擾組穿膜細(xì)胞較未干擾組、陰性干擾組

6、明顯減少（P<0.05）；未干擾組與陰性干擾組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。表明干擾LIMK1可抑制MGC803細(xì)胞侵襲，并增強(qiáng)DADS抑制MGC803細(xì)胞侵襲能力。
　　3. RAN干擾LIMK1與DADS對Rac1-Rock1/Pak1-LIMK1-cofilin1信號通路的影響。
　　Western blot結(jié)果顯示，干擾組的Rac1、Rock1、Pak1、cofilin1蛋白表達(dá)較未干擾組無統(tǒng)計學(xué)意義，LIMK1

7、、p-cofilin1蛋白表達(dá)均下降，未干擾組與陰性干擾組無統(tǒng)計學(xué)意義。30 mg·L-1DADS處理24h后，干擾組的Rac1、Rock1、Pak1蛋白表達(dá)均較處理前下降，LIMK1、p-cofilin1、cofilin1蛋白表達(dá)無差異；未干擾組與陰性干擾組無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、RNA干擾LIMK1可抑制MGC803細(xì)胞遷移與侵襲。
　　2、RNA干擾LIMK1增強(qiáng)DADS抑制MGC803細(xì)胞侵襲。