DADS影響人胃癌MGC803干樣細(xì)胞增殖及作用機制的初步研究.pdf

1、目的：腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤中具有自我更新能力，目前大部分學(xué)者認(rèn)為是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、耐藥、轉(zhuǎn)移及持續(xù)生長的根源。本文研究的目的在于從人低分化胃癌細(xì)胞系 MGC803中分離出胃癌干樣細(xì)胞，初步證明其具有腫瘤干樣細(xì)胞的特性；觀察二烯丙基二硫（diallyl disulfide,DADS）對胃癌干樣細(xì)胞的生長抑制作用，分析其作用機制與Sonic hedgehog信號通路中Shh、Gli1表達(dá)的關(guān)系。

2、r>　　方法：
　　1、無血清培養(yǎng)法培養(yǎng) MGC803腫瘤細(xì)胞球；流式細(xì)胞技術(shù)檢測胃癌干樣細(xì)胞和MGC803細(xì)胞的CD44、CD24的表達(dá)率；通過熒光顯微鏡觀察二者細(xì)胞CD24、CD44的陽性表達(dá)；MTT、Transwell侵襲實驗、軟瓊脂集落形成實驗觀察胃癌干樣細(xì)胞的增殖和侵襲能力；RT-PCR、Western blot技術(shù)分別從mRNA和蛋白水平檢測干細(xì)胞信號通路相關(guān)調(diào)控基因Shh、Gli1在胃癌干樣細(xì)胞中表達(dá)的變化。

3、　　2、MTT、軟瓊脂集落形成實驗觀察DADS對胃癌干樣細(xì)胞增殖能力的影響；RT-PCR、Western blot技術(shù)從mRNA和蛋白水平分析DADS對胃癌干樣細(xì)胞中Shh、Gli1表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1．無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)胃癌干樣細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，孔板內(nèi)腫瘤細(xì)胞呈球狀生長，形成典型腫瘤球。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，胃癌干樣細(xì)胞組CD24陽性細(xì)胞的比例高達(dá)91.21％，胃癌MGC803細(xì)胞中CD24陽性細(xì)胞的百分比為45.56%；

4、胃癌干樣細(xì)胞組CD44陽性細(xì)胞的比例高達(dá)91.93%，胃癌MGC803細(xì)胞中CD44陽性細(xì)胞的百分比為82.99%，分離的細(xì)胞可以初步認(rèn)為是胃癌干樣細(xì)胞。
　　2．熒光顯微鏡下觀察可見孵育了CD24抗體和CD44抗體的胃癌干樣細(xì)胞組胞膜上呈現(xiàn)強綠色熒光，陽性表達(dá)率高，而胃癌 MGC803細(xì)胞上只有個別細(xì)胞有微弱熒光，陽性表達(dá)率低。
　　3. MTT實驗結(jié)果顯示：胃癌干樣細(xì)胞的OD值（0.889±0.042）明顯大于MGC80

5、3細(xì)胞（0.494±0.029），提示胃癌干樣細(xì)胞的增殖能力明顯高于MGC803細(xì)胞（P<0.05）。軟瓊脂集落形成實驗結(jié)果顯示，與MGC803細(xì)胞（10.17±1.7）相比，胃癌干樣細(xì)胞集落形成數(shù)（29.83±1.4）明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在集落形態(tài)上，胃癌干樣細(xì)胞和MGC803細(xì)胞相比，集落直徑明顯變大，且集落中細(xì)胞數(shù)目增加。Tanswell侵襲實驗可見胃癌干樣細(xì)胞中穿透微孔膜的細(xì)胞個數(shù)（636±45）明顯多于

6、MGC803細(xì)胞（170±21），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　4. RT-PCR結(jié)果顯示：胃癌干樣細(xì)胞中Shh基因和Gli1基因mRNA表達(dá)均明顯高于胃癌MGC803細(xì)胞(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示：SHH蛋白和GLI1蛋白在胃癌干樣細(xì)胞均表達(dá)明顯高于胃癌MGC803細(xì)胞(P<0.05)。
　　5. MTT結(jié)果顯示：30mg/L DADS處理48 h后胃癌干樣細(xì)胞組OD值（0.530±0.3

7、19）和胃癌MGC803細(xì)胞組OD值（0.352±0.027）明顯低于未處理胃癌干樣細(xì)胞組（0.826±0.032）、MGC803細(xì)胞組（0.565±0.023）(P<0.05)；然而DADS處理后胃癌干樣細(xì)胞組OD值（0.530±0.319）還是高于DADS處理MGC803細(xì)胞（0.352±0.027）(P<0.05)。
　　6.軟瓊脂集落形成實驗發(fā)現(xiàn)，DADS處理后胃癌干樣細(xì)胞組形成的集落小于未處理的胃癌干樣細(xì)胞組，且集落形成

8、數(shù)目(15±1.5)也少于未處理組(35.5±2.5)(P<0.05)。DADS處理MGC803細(xì)胞后形成的集落比未處理MGC803細(xì)胞組小，且集落形成數(shù)目(6.5±0.5)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于未處理組(14.5±0.5)(P<0.05)。我們還將DADS處理后MGC803細(xì)胞、胃癌干樣細(xì)胞兩組進行比較發(fā)現(xiàn)，DADS處理后 MGC803細(xì)胞所形成的集落也小于胃癌干樣細(xì)胞，且集落形成數(shù)目(6.5±0.5)也比胃癌干樣細(xì)胞組(15±1.5)少(P<0.

9、05)。
　　7. RT-PCR實驗結(jié)果：用濃度為30mg/L的DADS處理MGC803細(xì)胞和胃癌干樣細(xì)胞48 h后Shh、Gli1基因表達(dá)均明顯下調(diào)(P<0.05)。Western blot結(jié)果同樣顯示，濃度為30mg/L的DADS處理48 h可明顯抑制MGC803細(xì)胞和胃癌干樣細(xì)胞中SHH、GLI1蛋白表達(dá)(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、初步分離和鑒定了人胃癌細(xì)胞MGC803細(xì)胞系中的胃癌干樣細(xì)胞；