DADS抑制CD44+人胃癌細(xì)胞AGS“干樣”特性的作用研究.pdf

1、目的:
　　腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，是腫瘤持續(xù)生長的根源。研究發(fā)現(xiàn)胃癌中存在胃癌干細(xì)胞（gastric cancer stem cells,GCSCs）。本研究的目的在于利用免疫磁珠分選技術(shù)(magnetic cell sorting,MACS)分選出CD44(+)AGS細(xì)胞，并從細(xì)胞增殖、腫瘤球形成、分化、耐藥性、侵襲遷移及體內(nèi)致瘤能力等方面

2、，闡明 CD44(+)AGS細(xì)胞的GCSCs樣生物學(xué)特性；探討二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）對CD44(+)AGS細(xì)胞生長的抑制作用及對細(xì)胞周期的影響，為闡明DADS抗胃癌作用提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　MACS技術(shù)分選人胃癌AGS細(xì)胞中的CD44(+)AGS細(xì)胞亞群，流式細(xì)胞術(shù)檢測分選的效率和細(xì)胞周期分布；腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)觀察CD44(+)細(xì)胞的增殖能力；免疫熒光檢測CD44(+)細(xì)胞

3、亞群的腫瘤球的分化情況；MTT實(shí)驗(yàn)檢測CD44(+)和CD44(-)AGS細(xì)胞亞群對化療藥物氟尿嘧啶和依托泊苷的敏感性；采用遷移侵襲實(shí)驗(yàn)鑒定CD44(+)和CD44(-)AGS細(xì)胞亞群遷移侵襲能力；裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)分析兩個(gè)亞群細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤性；MTT法觀察DADS對AGS細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)等方法，研究DADS對 CD44(+)AGS細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果:
　　1.流式細(xì)胞術(shù)

4、結(jié)果表明，在AGS人胃癌細(xì)胞系中大約有2.8％的CD44(+)AGS細(xì)胞，通過免疫磁珠術(shù)分選后，CD44(+)AGS細(xì)胞的細(xì)胞中CD44陽性率高達(dá)99.9%，而CD44(-)AGS細(xì)胞的CD44(+)亞群細(xì)胞百分比只有0.3%；
　　2.腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分選后的CD44(+)AGS細(xì)胞接種到無血清培養(yǎng)基中，2周后即形成典型的腫瘤球，其腫瘤球形成率可達(dá)74.3%；而CD44(-)AGS細(xì)胞不具有形成腫瘤球能力；
　　3.流

5、式細(xì)胞術(shù)顯示，CD44(+)AGS細(xì)胞的增殖率為59.6%，CD44(-)AGS細(xì)胞的細(xì)胞增殖率為28.3%；免疫熒光觀察顯示，CD44(+)AGS細(xì)胞可清晰地觀察到胞膜上的綠色熒光，而CD44(-)AGS細(xì)胞只有個(gè)別細(xì)胞有弱綠色熒光，陽性表達(dá)率極低；
　　4.分化實(shí)驗(yàn)顯示，腫瘤球細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中貼壁生長，胞質(zhì)向外伸出突起，CD44熒光表達(dá)明顯減弱，遷移出的細(xì)胞包膜上無綠色熒光，在無血清培養(yǎng)基中腫瘤球細(xì)胞CD44表達(dá)明顯，細(xì)胞

6、膜上有較強(qiáng)綠色熒光；
　　5.耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：倒置顯微鏡下可見，CD44(-)AGS細(xì)胞在化療藥物作用下細(xì)胞數(shù)減少明顯多于CD44(+)AGS細(xì)胞；MTT結(jié)果顯示，CD44(-)AGS細(xì)胞對化療藥物5-FU和VP-16的敏感性明顯高于CD44(+)AGS細(xì)胞；
　　6.侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)移及侵襲至微孔膜下層的CD44(+)AGS細(xì)胞均比CD44(-)AGS細(xì)胞多；
　　7.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，CD44(+)AGS

7、細(xì)胞中2×103個(gè)細(xì)胞組未成瘤，2×104個(gè)細(xì)胞組成瘤率為75%，2×105個(gè)細(xì)胞組成瘤率100%，且瘤體較大，而CD44(-)AGS細(xì)胞各組均無裸鼠成瘤；
　　8. DADS對CD44(+)AGS細(xì)胞抑制作用實(shí)驗(yàn)中，軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)顯示DADS可呈濃度依賴性抑制CD44(+)AGS細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測經(jīng) DADS處理后的CD44(+)AGS細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，且呈濃度和時(shí)間依賴性。
　　結(jié)論:
　　1.CD4