抑制ISL1的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞特性影響的研究.pdf

1、胃癌是目前世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤,其具有發(fā)病率高、死亡率高、早期診斷率較低,生存率低等特點(diǎn)。有許多研究表明,胃癌存在基因的表達(dá)異常,如 P15、P53、FHIT、CD44等,但這些對(duì)于研究胃癌細(xì)胞特性及其耐藥性方面還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。ISL1(胰島素基因增強(qiáng)結(jié)合蛋白1)為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子——Islet-1,其對(duì)胰島細(xì)胞成熟、增殖和分化都具有重要作用。我們前期有研究,通過高通量的實(shí)驗(yàn)技術(shù),發(fā)現(xiàn)ISL1在胃癌側(cè)群細(xì)胞中高表達(dá)。我們用 RNA干

2、擾的方法抑制 ISL1在胃癌BGC823中的表達(dá),來(lái)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的特性發(fā)生何種變化,為胃癌的治療提供更好的理論依據(jù)。
　　第一部分下調(diào) ISL1的表達(dá)對(duì)胃癌BGC823特性的影響
　　目的:
　　構(gòu)建針對(duì)人胰島素基因增強(qiáng)結(jié)合蛋白1(ISL1)的小干擾 RNA,將小干擾RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)BGC823細(xì)胞中,下調(diào)ISL1的表達(dá),來(lái)檢測(cè)胃癌細(xì)胞特性的變化。
　　方法:
　　從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取人ISL1基因編碼序列全

3、長(zhǎng),利用siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)干涉靶點(diǎn)和隨機(jī)的不靶向任何基因的陰性對(duì)照。將小干擾RNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞系 BGC823,逆轉(zhuǎn)錄酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和免疫印跡法(Western-blotting)等生物化學(xué)技術(shù),檢測(cè)ISL1基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。并用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖。用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。
　　結(jié)果:
　　1小干擾RNA序列:
　　ISL1-siRNA序列為:5

4、’-GCUCCAAGGUGUAUCACAUTT-3’(正義)5’-AUGUGAUACACCUUGGAG-3’(反義)。
　　陰性對(duì)照序列為:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(正義)5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(反義)。
　　GAPDH陽(yáng)性對(duì)照序列為:5’-GUAUDACAACAGCCUCAAGTT-3’(正義)5’-CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT-3’(反義)。

5、r>　　2測(cè)定轉(zhuǎn)染后ISL1基因在胃癌BGC823細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)情況。
　　2.1 ISL1mRNA在胃癌BGC823細(xì)胞中表達(dá)下降。
　　經(jīng)半定量RT-PCR分析,ISL1siRNA下調(diào)ISL1 mRNA的表達(dá),使其表達(dá)明顯減少。經(jīng)過ISL1siRNA轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞24h后與空白對(duì)照組相比,ISL1 mRNA表達(dá)水平分別為(0.658±0.032)和(1.371±0.022),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

6、5)。
　　2.2 ISL1蛋白在胃癌BGC823細(xì)胞中表達(dá)下降
　　經(jīng) Western-Blot檢測(cè) ISL1蛋白發(fā)現(xiàn),經(jīng)過 ISL1siRNA轉(zhuǎn)染48h后與空白及陰性對(duì)照組相比, ISL1siRNA組 ISL1蛋白表達(dá)水平(0.900±0.133)較空白組(1.710±0.150)及陰性對(duì)照組(1.630±0.126)減少,相比具有顯著性差異(P<0.05)。
　　3 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞的增殖
　　通過檢測(cè)

7、各組細(xì)胞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值,以培養(yǎng)時(shí)間為X軸,對(duì)應(yīng)的OD值為Y軸,得出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,結(jié)果表明siRNA-BGC823細(xì)胞的體外增殖能力明顯低于其余兩組細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性
　　經(jīng)過PTX、5-Fu、VP-16三種藥物分別作用48h后,BGC823細(xì)胞的耐藥存活率分別為44％、57%、61%;而siRNA-BGC823細(xì)胞的耐藥存活率分別為26%、39%、43

8、%。結(jié)果表明, siRNA-BGC823細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性明顯高于BGC823細(xì)胞(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　構(gòu)建針對(duì)人ISL1的siRNA,成功轉(zhuǎn)染胃癌BGC823細(xì)胞,經(jīng)鑒定能明顯抑制 ISL1mRNA及蛋白的表達(dá)。ISL1表達(dá)下調(diào)可明顯抑制胃癌BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖速度,并增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性。表明ISL1基因?qū)ξ赴┘?xì)胞的生長(zhǎng)增殖及耐藥性方面有著重要影響。
　　第二部分富集BGC823側(cè)群細(xì)胞

9、,觀察下調(diào)ISL1對(duì)其特性的影響
　　目的:
　　用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法分離 BGC823中的側(cè)群細(xì)胞,檢測(cè) BGC823細(xì)胞及其側(cè)群細(xì)胞在增殖及藥物敏感性方面的變化。將小干擾RNA轉(zhuǎn)染至BGC823-SP細(xì)胞,下調(diào)ISL1的表達(dá),來(lái)觀察胃癌干細(xì)胞特性的變化。
　　方法:
　　無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法富集 BGC823側(cè)群細(xì)胞,用 MTT法及 CCK-8法檢測(cè)其在增殖及藥物敏感性方面的變化。將小干擾 RNA轉(zhuǎn)染至BGC823

10、-SP細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)錄酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( RT-PCR)和免疫印跡法(Western-blotting)等生物化學(xué)技術(shù),檢測(cè)ISL1基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。并用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖。用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。
　　結(jié)果:
　　1成功富集BGC823側(cè)群細(xì)胞(BGC823-SP)
　　2 BGC823及BGC823-SP細(xì)胞的增殖速度及對(duì)化療藥物敏感性的對(duì)比
　　2.1 MTT比色法測(cè)定BGC

11、823及BGC823-SP細(xì)胞的細(xì)胞增殖的對(duì)比
　　通過檢測(cè)各組細(xì)胞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值,以培養(yǎng)時(shí)間為X軸,對(duì)應(yīng)的OD值為Y軸,得出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,結(jié)果表明BGC823-SP細(xì)胞的體外增殖能力明顯強(qiáng)于BGC823細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.2 CCK-8法測(cè)定BGC823及BGC823-SP細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性
　　經(jīng)過PTX、5-Fu、VP-16三種藥物分別作用48h后,BGC823細(xì)胞的耐藥存活

12、率分別為44%、57%、61%;而 BGC823-SP細(xì)胞的耐藥存活率分別為56%、67%、70%。結(jié)果表明,BGC823-SP細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性明顯低于BGC823細(xì)胞(P<0.05)。
　　3測(cè)定siRNA轉(zhuǎn)染后ISL1基因在胃癌BGC823-SP細(xì)胞中mRNA及蛋白表達(dá)情況。
　　3.1 ISL1mRNA在胃癌BGC823-SP細(xì)胞中表達(dá)下降。
　　經(jīng)半定量RT-PCR分析,ISL1siRNA下調(diào)ISL1 m

13、RNA的表達(dá),使其表達(dá)明顯減少。經(jīng)過ISL1siRNA轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞24h后與空白對(duì)照組相比,ISL1 mRNA表達(dá)水平分別為(0.403±0.001)和(1.428±0.302),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.2 ISL1蛋白在胃癌BGC823-SP細(xì)胞中表達(dá)下降。
　　經(jīng)Western-Blot檢測(cè)ISL1蛋白發(fā)現(xiàn),經(jīng)過ISL1siRNA轉(zhuǎn)染48h后與空白及陰性對(duì)照組相比,ISL1siRNA組ISL

14、1蛋白表達(dá)水平(0.592±0.187)較空白組(1.847±0.193)及陰性對(duì)照組(1.700±0.165)減少,相比具有顯著性差異(P<0.05)。
　　4 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞的增殖
　　通過檢測(cè)各組細(xì)胞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值,以培養(yǎng)時(shí)間為X軸,對(duì)應(yīng)的OD值為Y軸,得出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,結(jié)果表明siRNA-BGC823-SP細(xì)胞的體外增殖能力明顯弱于 BGC823-SP細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5

15、CCK-8測(cè)定細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性
　　經(jīng)過 PTX、5-Fu、VP-16三種藥物分別作用48h后,BGC823-SP細(xì)胞的耐藥存活率分別為56%、67%、70%;而siRNA-BGC823-SP細(xì)胞的耐藥存活率分別為20%、31%、33%。結(jié)果表明, siRNA-BGC823-SP細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性明顯高于BGC823-SP細(xì)胞(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　胃癌 BGC823-SP細(xì)胞的體外增殖能力及其耐