谷氨酰胺酶在胃癌中的表達(dá)及對(duì)胃癌細(xì)胞生長增殖的影響.pdf

1、目的：胃癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率較高，是當(dāng)前威脅我國人民身體健康的重大疾病。在腫瘤細(xì)胞中，能量代謝發(fā)生了許多改變，谷氨酰胺（glutamine）是一種重要的代謝底物，可以為迅速增殖中的癌細(xì)胞提供充足的碳源、氮源和能量，此外，谷氨酰胺代謝還能參與信號(hào)傳導(dǎo)，甚至在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)等方面都具有重要意義。近年來，腫瘤細(xì)胞中谷氨酰胺代謝的改變逐漸引起重視，異常的谷氨酰胺代謝對(duì)癌細(xì)胞生長增殖的作用成為了代謝方面研究的熱點(diǎn)。谷

2、氨酰胺酶（glutaminase，GLS）能夠?qū)⒐劝滨０反呋纸馍晒劝彼幔枪劝滨０反x環(huán)節(jié)的關(guān)鍵酶，也是限速酶，抑制GLS將會(huì)降低谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的能量供應(yīng)，使對(duì)谷氨酰胺“上癮”的一些腫瘤細(xì)胞的生長受到影響。因此，本文以正常胃黏膜組織和胃黏膜上皮細(xì)胞為對(duì)照，觀察GLS在胃癌組織和胃癌細(xì)胞的表達(dá)，并選用GLS的抑制劑CB-839，進(jìn)一步研究谷氨酰胺及GLS對(duì)胃癌細(xì)胞生長增殖的影響，以期發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞能量代謝通路的關(guān)鍵點(diǎn)，為胃癌的臨床治療

3、提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴選取正常胃黏膜及胃癌組織標(biāo)本，采用免疫組化技術(shù)檢測GLS在組織中的表達(dá)情況。⑵選擇胃癌細(xì)胞MGC-803和SGC-7901作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1作為參照。⑶三種細(xì)胞設(shè)置含2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液的對(duì)照組，不含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液的實(shí)驗(yàn)組，以谷氨酰胺饑餓實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的生長情況，探討胃癌細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的依賴作用。⑷收集對(duì)數(shù)期的GES-1、MGC-803、SG

4、C-7901細(xì)胞，提取總蛋白，western blot方法檢測GLS在細(xì)胞中的表達(dá)。⑸收集對(duì)數(shù)期的GES-1、MGC-803、SGC-7901細(xì)胞，用谷氨酰胺酶活性試劑盒，以分光光度法檢測GLS活性。⑹設(shè)空白對(duì)照組，CB-839的1μmol/l處理組，采用MTT比色法檢測各組細(xì)胞的吸光度，探討抑制GLS對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803和胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1存活率的影響。⑺設(shè)空白對(duì)照組，CB-839的1μmol/l處理組，采

5、用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組的細(xì)胞周期，探討抑制GLS對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803和胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：①正常胃黏膜及胃癌組織中的GLS表達(dá)情況：結(jié)果顯示，正常胃黏膜組織中的GLS陽性表達(dá)率低，而胃癌組織中GLS陽性表達(dá)率較高（P<0.05），在30例胃癌組織中19例GLS高表達(dá)，其中，11例為低分化胃癌組織，其余均為低-中分化和中分化胃癌組織。②谷氨酰胺饑餓實(shí)驗(yàn)檢測胃癌細(xì)胞對(duì)谷氨酰胺的依賴作

6、用：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MGC-803細(xì)胞在培養(yǎng)過程對(duì)谷氨酰胺表現(xiàn)出了較高的依賴性，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組MGC-803細(xì)胞的生長受到了嚴(yán)重的影響，在培養(yǎng)的第3天，出現(xiàn)部分漂浮的細(xì)胞，第5天出現(xiàn)大量的漂浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞狀態(tài)不良，細(xì)胞數(shù)量增加緩慢，到了第7天，幾乎所有貼壁細(xì)胞脫落，呈漂浮狀態(tài)，表明MGC-803細(xì)胞因?yàn)槿狈劝滨０?，其生長受到了嚴(yán)重的影響（P<0.01）；谷氨酰胺缺失對(duì)SGC-7901細(xì)胞的影響相對(duì)較小，與未缺失谷氨酰胺的對(duì)照組之

7、間的差異在第7天才表現(xiàn)出來（P<0.05）；谷氨酰胺缺失對(duì)人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1的生長增殖無明顯影響（P>0.05）。③Western blot方法檢測每種細(xì)胞GLS的蛋白表達(dá)：胃癌細(xì)胞SGC-7901與胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中GLS蛋白表達(dá)的差異不顯著（P>0.05），而在胃癌細(xì)胞MGC-803中存在GLS蛋白的高表達(dá)，灰度值是GES-1細(xì)胞的兩倍（P<0.01）。④分光光度法檢測每種細(xì)胞GLS的酶活性：與胃黏膜上皮細(xì)胞GES-

8、1相比，胃癌細(xì)胞SGC-7901和MGC-803的GLS活性的增高均存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。⑤MTT法檢測抑制GLS對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803和胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1存活率的影響：三種細(xì)胞分別設(shè)陰性對(duì)照組和加藥組，結(jié)果顯示，GES-1加藥組與對(duì)照組比較，存活率未發(fā)生明顯的變化（P>0.05），但是兩種胃癌細(xì)胞加藥組與對(duì)照組相比，存活率均發(fā)生顯著改變，SGC-7901和MGC-803的存活率分別降低到（88

9、.32±5.44）％、（31.63±8.62）%，MGC-803加藥組與GES-1加藥組相比細(xì)胞存活率下降明顯（P<0.01）。⑥流式細(xì)胞術(shù)檢測抑制GLS對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC-803和胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞周期的影響：CB-839抑制GLS對(duì)GES-1的影響較小，而在胃癌細(xì)胞中，MGC-803的細(xì)胞周期發(fā)生了明顯的變化，G0/G1期、S期、G2/M期的比率由51.52%、39.38%、9.10%變成了38.78%、5

10、4.62%、6.60%，其中，S期細(xì)胞所占比例明顯增多（P<0.01），說明CB-839處理后，MGC-803細(xì)胞發(fā)生了S期阻滯；SGC-7901細(xì)胞經(jīng)CB-839處理后G0/G1期、S期、G2/M期的比率由41.06%、43.58%、15.36%變成了47.10%、42.95%、9.95%，G0/G1期細(xì)胞的比例有所增加（P<0.01）。
　　結(jié)論：谷氨酰胺酶在胃癌中高表達(dá)，胃癌細(xì)胞的生長對(duì)谷氨酰胺具有依賴性；抑制GLS能影響胃