Tspan5在胃癌中的表達(dá)及調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖機(jī)制的研究.pdf

1、胃癌(Gastric Carcinoma，GC)是位于第四位人類最常見腫瘤，也是腫瘤相關(guān)性死亡最常見的原因之一。在2008年，全球總共有989，600新增胃癌病例和738，000例胃癌估計(jì)死亡率，占全球癌癥病例總數(shù)的8％和估計(jì)癌癥死亡總?cè)藬?shù)的10％。而胃癌發(fā)病率最高的地區(qū)是在亞洲東部，東歐和南美。近年來(lái)，隨著診斷技術(shù)的進(jìn)步及針對(duì)腫瘤的外科手術(shù)和放化療治療策略的成熟，但由于胃癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后仍然并不令人十分滿意。此外，盡管TNM

2、(tumor-node-metastasis)臨床分期是使用最廣泛的分期系統(tǒng)，并對(duì)胃癌患者的預(yù)后有提示意義，但它依舊是很難獲得患者其它相對(duì)具體的臨床預(yù)后信息。因此，發(fā)展對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估預(yù)測(cè)的新的生物標(biāo)志物，對(duì)于目前來(lái)說(shuō)是非常迫切需要的。而且胃癌相關(guān)基因及其蛋白分子不僅在了解胃癌的發(fā)病機(jī)制方面十分重要，在臨床靶向性治療和改善預(yù)后等方面也意義重大。
　　Tspan5(tetraspanin5，net4，TMS4SF9)，屬于四分子交

3、聯(lián)體超家族(tetraspanin)中的一員。Tetraspanin是四次跨膜的小分子細(xì)胞膜蛋白(20-50kDa)，其特點(diǎn)是有四個(gè)比較保守的跨膜域(TM)。TM延伸到細(xì)胞膜外，形成一個(gè)小的胞外環(huán)和一個(gè)大的胞外環(huán)，而在胞內(nèi)則形成一個(gè)很短的氨基末端和一個(gè)羧基末端。Tetraspanin可以與其他同是Tetraspanin成員的細(xì)胞跨膜受體蛋白通過相互作用形成復(fù)合物，此復(fù)合物被稱為富含tetraspanin的胞膜微結(jié)構(gòu)域。在人類tetras

4、panin家族中已有33的成員被發(fā)現(xiàn)，但只有少數(shù)關(guān)于該家族成員在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上進(jìn)行研究。有幾項(xiàng)研究分別揭示在tetraspanin家族中，例如 TSPAN1(NET-1)、TSPAN13(NET-6)、 TSPAN24(CD151)、 TSPAN27(CD82)、 TSPAN28和TSPAN29(CD9)，表明他們?cè)谀承┤祟惏┌Y中下調(diào)或表達(dá)升高，這意味著這些tetraspanin成員可能參與腫瘤發(fā)生或腫瘤的進(jìn)展惡化。而相比之下，關(guān)于Ts

5、pan5在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移作用方面則所知甚少。
　　我們都知道惡性腫瘤的特點(diǎn)是無(wú)限增殖，其無(wú)限增殖多與細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡障礙密切相關(guān)。細(xì)胞周期進(jìn)程的失調(diào)被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。大量的研究表明，細(xì)胞周期失調(diào)在腫瘤復(fù)發(fā)及進(jìn)展方面負(fù)有很大的責(zé)任。在本文中，我們旨在研究Tspan5在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用及其臨床意義。此外，我們對(duì)Tspan5和胃癌細(xì)胞周期蛋白變化之間的關(guān)系非常感興趣，希望可以揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，發(fā)展

6、新的治療方法和預(yù)測(cè)疾病預(yù)后的生物標(biāo)志物。
　　目的:
　　1.明確Tspan5在臨床胃癌組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，與胃癌患者病情發(fā)展、預(yù)后的關(guān)系。
　　2.探討Tspan5在影響胃癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)方面的生物學(xué)作用。
　　3.在體內(nèi)外探討Tspan5對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　4.探討Tspan5在影響胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移方面的生物學(xué)作用。
　　方法:
　　1.采用組織免疫化學(xué)染色的方法在11

7、4例臨床胃癌組織標(biāo)本中，分析Tspan5的表達(dá)量與臨床胃癌發(fā)展、預(yù)后的關(guān)系。
　　2.基于基因克隆技術(shù)，將Tspan5片段克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒plncx2-GFP-IRES中，經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定正確無(wú)誤后，與pVSV-G共轉(zhuǎn)染至GP2-293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。將包裝的高表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胃癌AGS和MKN45細(xì)胞，而后經(jīng)G418初步篩選形成穩(wěn)定株，然后經(jīng)Western blot鑒定后，擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　3.

8、CCK-8法檢測(cè)穩(wěn)定高表達(dá)Tspan5的重組細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)情況，同時(shí)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組細(xì)胞在體外克隆形成的能力，然后將重組胃癌細(xì)胞在裸鼠皮下接種成瘤，觀察其在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。
　　4.通過流式細(xì)胞術(shù)分析Tspan5對(duì)胃癌AGS和MKN45細(xì)胞周期的影響。同時(shí)，通過蛋白電泳及瘤體組織片免疫組化對(duì)重組胃癌細(xì)胞周期蛋白分子CyclinD1、CDK4、p15、p27、E2F1和pRB的變化進(jìn)行驗(yàn)證。
　　5.細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)

9、和侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，劃痕實(shí)驗(yàn)分析Tspan5在重組胃癌AGS和MKN45細(xì)胞在體外的轉(zhuǎn)移能力所起的作用。
　　結(jié)果:
　　1.在114例臨床標(biāo)本中，通過免疫組化染色顯示，Tspan5低表達(dá)于胃癌組織而高表達(dá)于相應(yīng)癌旁組織。在癌組織中，Tspan5的表達(dá)量的高低與腫瘤大小、腫瘤侵襲程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床TNM分期密切相關(guān)。隨著TNM分期程度的升高，Tspan5表達(dá)量逐漸降低。在生存期分析中，低表達(dá)Tspan5癌組織的患者，與高

10、表達(dá)Tspan5癌組織的患者相比，其中位生存時(shí)間和生存率均顯著下降。
　　2.逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體plncx2-GFP-IRES/Tspan5經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定構(gòu)建成功，并與pVSV-G在GP2-293細(xì)胞中包裝得到了高表達(dá)Tspan5的逆轉(zhuǎn)錄病毒。該病毒感染的胃癌AGS和MKN45細(xì)胞經(jīng)高濃度G418篩選得到了穩(wěn)定的重組細(xì)胞株。重組細(xì)胞株經(jīng)Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)構(gòu)建成功。
　　3.CCK-8實(shí)驗(yàn)中高表達(dá)Tspan5的

11、胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞株，體外生長(zhǎng)速度明顯慢于對(duì)照細(xì)胞(AGS-RV和MKN45-RV);平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示高表達(dá)Tspan5的胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞株的體外克隆生長(zhǎng)能力明顯弱于對(duì)照細(xì)胞，克隆形成的大小也小于對(duì)照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)意義。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)也顯示了高表達(dá)Tspan5的胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞株的皮下成瘤速度及大小均明顯弱于對(duì)照組細(xì)胞（AGS-RV和MKN45-RV），差異具有統(tǒng)計(jì)意義。
　　4.我

12、們也進(jìn)一步證明Tspan5在從細(xì)胞周期G1期到S期的過渡階段進(jìn)行調(diào)控，是通過增加p15/p27蛋白的表達(dá)，同時(shí)減少細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1/CDK4/E2F1/p-RB的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
　　5.我們?cè)诟弑磉_(dá)Tspan5的重組胃癌細(xì)胞株中，通過轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-CDK4，重新高表達(dá)其CDK4蛋白量，并通過蛋白電泳證實(shí)上調(diào)成功。48小時(shí)后，我們使用CCK-8分析評(píng)估該重新高表達(dá)CDK4的細(xì)胞的增殖能力情況。我們發(fā)現(xiàn)在胃癌AG

13、S或MNK45細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pCMV-Myc-CDK4的高表達(dá)Tspan5的細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pCMV-Myc的高表達(dá)Tspan5的細(xì)胞相比，其增殖能力顯著升高，并較對(duì)照組（control組）的增殖能力升高。同樣，轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒pENTER-Cyclin D1后，其增殖能力也顯著增加，并較對(duì)照組（control組）增殖能力也升高。這表明Tspan5抑制胃癌細(xì)胞的增殖是通過控制細(xì)胞周期從G1期到S期的過渡階段，通過下調(diào)Cyclin D1

14、和CDK4蛋白表達(dá)量而實(shí)現(xiàn)的。
　　6.細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)和侵襲轉(zhuǎn)移運(yùn)動(dòng)(transwell)實(shí)驗(yàn)表明，Tspan5顯著抑制了胃癌AGS和MKN45細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。與transwell的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，劃痕實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果。因此，以上結(jié)果表明，Tspan5可能可作為抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的抑癌基因。
　　結(jié)論:
　　在臨床胃癌組織中，Tspan5低表達(dá)于癌組織而高表達(dá)于相應(yīng)癌旁組織,Tspan5的表達(dá)量的高低與腫瘤大

15、小、腫瘤侵襲程度、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床TNM分期密切相關(guān)。隨著TNM分期程度的升高，Tspan5表達(dá)量逐漸降低。在生存期分析中，低表達(dá)Tspan5癌組織的患者，與高表達(dá)Tspan5癌組織的患者相比，其中位生存時(shí)間和生存率均顯著下降。以上提示Tspan5可能是一個(gè)新的胃癌抑制分子。通過基因克隆技術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝技術(shù)和蛋白電泳驗(yàn)證，我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)Tspan5的胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞株。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

16、證實(shí)高表達(dá)Tspan5抑制胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞的體外增殖和生長(zhǎng)。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示高表達(dá)Tspan5抑制胃癌AGS細(xì)胞的成瘤能力。高表達(dá)Tspan5可以抑制胃癌AGS和MKN45重組細(xì)胞由G1期到S期的進(jìn)程，其分子機(jī)制是下調(diào)Cyclin D1、CDK4、pRB和E2F1蛋白分子的表達(dá)和上調(diào)抑癌因子p27和p15的表達(dá)。同時(shí)在裸鼠的移植瘤的免疫組化中，CyclinD1，CDK4，E2Fl，pRb，p27和p15這四種分子的變化