COX-2在胃癌細(xì)胞中調(diào)控15-PGDH表達(dá)的機(jī)制.pdf

1、【研究背景】
　　胃癌在全世界范圍內(nèi)屬于高發(fā)腫瘤，其死亡人數(shù)位居惡性腫瘤的第二位。其中約90％的病例組織學(xué)分型為胃腺癌。胃癌也是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居各類腫瘤的首位。闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對于改進(jìn)現(xiàn)有的治療措施具有積極意義。
　　胃癌的發(fā)生發(fā)展與胃粘膜慢性炎癥高度相關(guān)。在幽門螺桿菌感染基礎(chǔ)上繼發(fā)的胃粘膜慢性炎癥是胃癌發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。大量炎性介質(zhì)在胃粘膜炎癥局部長期積聚，可能為胃癌的發(fā)生提供了合適的

2、微環(huán)境。
　　COX-2催化生成前列腺素，是介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要分子。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2與腫瘤的關(guān)系也非常密切。COX-2在多種腫瘤組織中高表達(dá)；抑制COX-2表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞的增殖和促血管生成能力。在多數(shù)胃癌組織及胃癌細(xì)胞系中，COX-2異常高表達(dá)，可促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移及血管形成。而降低COX-2表達(dá)則可抑制胃癌細(xì)胞增殖，抑制血管形成，使細(xì)胞凋亡增加。
　　15-PGDH催化降解前列腺素，在體內(nèi)發(fā)揮與COX-2

3、相拮抗的功能，是負(fù)調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子。近年來人們發(fā)現(xiàn)15-PGDH與腫瘤也有密切關(guān)系，是一個(gè)潛在的抑癌基因。15-PGDH在肺癌，乳腺癌，甲狀腺癌，結(jié)腸癌等惡性腫瘤中低表達(dá)。第四軍醫(yī)大學(xué)腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西京醫(yī)院消化內(nèi)科劉震雄博士等研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，COX-2蛋白水平與15-PGDH負(fù)相關(guān)；在SGC-7901胃癌細(xì)胞中，COX-2可下調(diào)15-PGDH表達(dá)；15-PGDH在胃癌組織中低表達(dá)，其水平與腫瘤惡性程度負(fù)相關(guān)。但

4、是在COX-2調(diào)控15-PGDH表達(dá)的機(jī)制方面尚未進(jìn)行深入研究。本論文涉及的研究內(nèi)容是在此基礎(chǔ)上展開的，期望有助于闡明COX-2經(jīng)由15-PGDH調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的分子機(jī)制。
　　FOXA2，又名HNF3β，是廣泛分布于肝，肺，骨骼肌等組織的轉(zhuǎn)錄因子，在肺癌組織中FOXA2能直接結(jié)合于15-PGDH啟動(dòng)子區(qū)域，上調(diào)15-PGDH表達(dá)水平。但FOXA2在胃癌中發(fā)揮的作用尚未見報(bào)道。因此我們在胃癌中對FOXA2表達(dá)情況，及其調(diào)控

5、15-PGDH表達(dá)的可能機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　DNA的甲基化/去甲基化過程是脊椎動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，幾乎所有在人體內(nèi)廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)均受到甲基化/去甲基化機(jī)制的調(diào)控。抑癌基因的過甲基化是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。因此我們考慮探討COX-2是否可能通過升高FOXA2啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，抑制FOXA2mRNA轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控FOXA2和15-PGDH的表達(dá)。
　　【研究結(jié)果】
　　1.COX-2在不同分化程度胃癌細(xì)胞

6、中均能負(fù)調(diào)控15-PGDH表達(dá)
　　在MKN-28，AGS，SGC-7901及MKN-45胃癌細(xì)胞系中，高表達(dá)COX-2均能抑制15-PGDH表達(dá)，在人永生化胃粘膜上皮細(xì)胞系GES-1中也獲得了相似的結(jié)果；在不同分化程度的胃癌細(xì)胞及GES-1細(xì)胞中干涉COX-2表達(dá)則能上調(diào)15-PGDH表達(dá)水平；LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源性COX-2也能顯著抑制SGC-7901細(xì)胞中15-PGDH表達(dá)；與之相反，COX-2選擇性抑制劑Celecoxib

7、顯著上調(diào)SGC-7901細(xì)胞中15-PGDH表達(dá)水平。COX-2在胃癌細(xì)胞中對15-PGDH的抑制效應(yīng)得到進(jìn)一步證實(shí)。
　　2.COX-2通過降低FOXA2水平抑制胃癌細(xì)胞中15-PGDH表達(dá)
　　不同分化程度的胃癌細(xì)胞系及永生化胃粘膜上皮細(xì)胞中均有FOXA2表達(dá)，高分化胃癌細(xì)胞中FOXA2表達(dá)量較高；胃潰瘍粘膜及高分化胃癌組織中FOXA2表達(dá)強(qiáng)于低分化胃癌組織（p<0.05），TNMI期和Ⅱ期患者胃癌組織中FOXA2表達(dá)強(qiáng)

8、于TNMⅢ期和IV期患者胃癌組織（p<0.05），胃癌惡性程度越高，其中FOXA2表達(dá)水平越低；在SGC-7901細(xì)胞中，過表達(dá)COX-2或LPS誘導(dǎo)生成的COX-2均能使SGC-7901細(xì)胞中FOXA2mRNA及蛋白水平降低，而干涉COX-2或抑制COX-2活性均能提高SGC-7901細(xì)胞中FOXA2mRNA及蛋白水平。
　　在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染COX-2的SGC-7901-COX2細(xì)胞中，15-PGDH蛋白表達(dá)被抑制，給予SGC-790

9、1-COX2細(xì)胞以外源性的FOXA2可以抵消COX-2對15-PGDH表達(dá)的抑制效應(yīng)，并降低SGC-7901-COX2細(xì)胞的PGE2分泌量，提高SGC-7901-COX2細(xì)胞凋亡率；與之相反，在低表達(dá)COX-2的SGC-7901-COX2shRNA細(xì)胞中，15-PGDH蛋白水平較高，干涉SGC-7901細(xì)胞中的FOXA2可以使15-PGDH蛋白水平下降，并升高SGC-7901-COX2shRNA細(xì)胞的PGE2分泌量，降低SGC-7901

10、-COX2shRNA細(xì)胞凋亡率；COX-2對15-PGDH表達(dá)的下調(diào)效應(yīng)須由FOXA2介導(dǎo)。
　　FOXA2可激活SGC-7901細(xì)胞中pGL3-PGDH報(bào)告基因的表達(dá)，但是當(dāng)COX-2高表達(dá)時(shí)，F(xiàn)OXA2對pGL3-PGDH報(bào)告基因的激活受到限制；COX-2抑制胃癌細(xì)胞中FOXA2與15-PGDH啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，部分阻斷了15-PGDH的轉(zhuǎn)錄起始過程。
　　胃癌細(xì)胞中，COX-2通過抑制FOXA2mRNA轉(zhuǎn)錄，下調(diào)FOX

11、A2表達(dá)，低水平的FOXA2繼而導(dǎo)致依賴FOXA2轉(zhuǎn)錄因子活性的15-PGDH轉(zhuǎn)錄起始過程受抑制，15-PGDH表達(dá)量也隨之下降。
　　3.COX-2通過增強(qiáng)FOXA2啟動(dòng)子CpG島甲基化抑制FOXA2表達(dá)
　　不同分化程度的胃癌細(xì)胞（MKN-28，SGC-7901及原代低分化胃腺癌細(xì)胞）中FOXA2啟動(dòng)子CpG區(qū)域甲基化比例均高于癌旁組織細(xì)胞及永生化胃粘膜上皮細(xì)胞；過表達(dá)COX-2或用LPS誘導(dǎo)內(nèi)源性COX-2時(shí)，F(xiàn)OXA

12、2啟動(dòng)子CpG島甲基化比例高于COX-2低表達(dá)狀態(tài)，干涉COX-2或抑制COX-2活性時(shí)FOXA2啟動(dòng)子CpG區(qū)域甲基化比例低于COX-2高表達(dá)狀態(tài)，COX-2促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞中FOXA2啟動(dòng)子CpG島甲基化。
　　DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑提高COX-2高表達(dá)SGC-7901細(xì)胞中FOXA2和15-PGDH表達(dá)水平，5-Az作用下，COX-2對FOXA2和15-PGDH表達(dá)的抑制效應(yīng)減弱，COX-2對FOXA2表達(dá)的抑制需要

13、甲基化過程的參與；5-Az可提高COX-2高表達(dá)SGC-7901-COX2細(xì)胞中FOXA2mRNA水平，COX-2可能通過促甲基化機(jī)制，抑制FOXA2基因啟動(dòng)子形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而降低FOXA2表達(dá)。
　　【研究結(jié)論】
　　1.在胃癌細(xì)胞中，COX-2可提高FOXA2基因啟動(dòng)子CpG島甲基化水平，進(jìn)而間接抑制FOXA2mRNA轉(zhuǎn)錄，降低FOXA2表達(dá)水平。
　　2.COX-2通過降低胃癌細(xì)胞中FOXA2表達(dá)水平，抑