TRIM67對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及凋亡影響機(jī)制的研究.pdf

1、目的:三結(jié)構(gòu)域蛋白67（TRIM67）是三結(jié)構(gòu)域蛋白家族的其一個(gè)成員，它在胃癌中處于沉默或下調(diào)的狀態(tài)，目前在胃癌中未見相關(guān)文獻(xiàn)，其作用機(jī)制尚不明確。我們通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（ Real-time PCR）、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）及流式細(xì)胞術(shù)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證TRIM67與胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等之間的關(guān)系。主要闡明該基因在胃癌中作為一個(gè)腫瘤抑制基因的生物學(xué)功能。
　　方法:
　　1、選取21對(duì)香港中文

2、大學(xué)威爾斯親王醫(yī)院的胃癌組織和癌旁正常組織樣本為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）測(cè)定TRIM67基因在這21對(duì)樣本中的表達(dá)水平，并分析胃癌組織和癌旁正常組織中TRIM67的表達(dá)水平差異。
　　2、運(yùn)用相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，①反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）驗(yàn)證TRIM67在胃癌細(xì)胞株（AGS、BGC823

3、、MGC803、MKN1、MKN45、MKN74、SNU1、SNU638）中的表達(dá)水平；②運(yùn)用亞硫酸氫鹽測(cè)序法（bisulfite genomic sequencing, BGS）對(duì)相關(guān)胃癌細(xì)胞株中TRIM67啟動(dòng)子序列進(jìn)行檢測(cè)；③應(yīng)用2uM濃度的5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza）對(duì)胃癌細(xì)胞株（AGS、BGC823、MKN45、SNU1、SNU638）去甲基化處理96小時(shí)后，通過RT-PC

4、R檢測(cè)細(xì)胞株中的TRIM67的表達(dá)水平，并以未用5-Aza處理的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。
　　3、構(gòu)建 pcDNA3.1-2×Flag-TRIM67重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株 AGS和 MKN1，以 pcDNA3.1-vector為對(duì)照組，G418篩選出 AGS和 MKN1穩(wěn)定細(xì)胞株后，分別以 mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)該胃癌細(xì)胞株過表達(dá)TRIM67后的表達(dá)。運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明TRIM67對(duì)胃癌細(xì)胞株細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響，并通過軟瓊脂克隆

5、形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生長(zhǎng)及集落形成能力的作用情況。以 TRIM67表達(dá)較高的胃癌細(xì)胞株MKN74為基礎(chǔ)，應(yīng)用shRNA（short hairpin RNA）敲低TRIM67并獲得穩(wěn)定細(xì)胞株。在mRNA水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染該基因的表達(dá)情況，并運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低 TRIM67后對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及集落形成的能力。
　　4、以胃癌細(xì)胞株AGS和MKN1轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-2×Flag-TRIM67的穩(wěn)定細(xì)胞株和 p

6、cDNA3.1-vector對(duì)照組的穩(wěn)定細(xì)胞株為基礎(chǔ)，用碘化丙啶（PI）對(duì)胃癌細(xì)胞株進(jìn)行染色以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞周期變化，運(yùn)用Flowjo軟件分析TRIM67基因的與胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期的關(guān)系和作用。應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4、P21和P27進(jìn)行檢測(cè)，以明確TRIM67對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的作用影響。
　　5、應(yīng)用 Annexin V和7-AAD（7-amino-actinomycin）

7、雙染過表達(dá)TRIM67的胃癌細(xì)胞株AGS和MKN1，通過流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞凋亡的情況，對(duì)TRIM67基因影響胃癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)一步分析。并運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法對(duì)細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白如活化形式的 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly ADP ribose polymerase, PARP）進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證TRIM67對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　結(jié)果

8、:
　　1、胃癌組織及癌旁正常組織中TRIM67的表達(dá)變化
　　選取21對(duì)胃癌組織及癌旁正常組織對(duì)TRIM67基因的mRNA水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)表明胃癌組織中TRIM67的表達(dá)較癌旁正常組織中該基因的表達(dá)水平下調(diào)（P<0.01, n=21）。
　　2、TRIM67在胃癌細(xì)胞株中表達(dá)情況及其啟動(dòng)子甲基化水平的關(guān)系
　　我們首先在胃癌細(xì)胞株中對(duì)TRIM67基因mRNA水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) TRIM67在8個(gè)胃癌細(xì)

9、胞株中7個(gè)細(xì)胞株（AGS、BGC823、MGC803、MKN45、MKN1、SNU1、SNU638）的表達(dá)沉默或明顯下調(diào)，胃癌細(xì)胞株 MKN74及人胃粘膜上皮細(xì)胞株（GES1）有一定表達(dá)水平，在正常胃粘膜上皮組織中表達(dá)正常。進(jìn)而我們用亞硫酸氫鹽測(cè)序法測(cè)定TRIM67啟動(dòng)子序列的CpG甲基化位點(diǎn)及甲基化程度。我們發(fā)現(xiàn)7條胃癌細(xì)胞株的TRIM67啟動(dòng)子序列甲基化程度較高，而MKN74和GES1該基因的啟動(dòng)子序列甲基化程度較低，而在胃正常上皮

10、粘膜組織中未發(fā)現(xiàn)甲基化。我們應(yīng)用5-Aza對(duì)胃癌細(xì)胞株（AGS、BGC823、MKN45、SNU1、SNU638）進(jìn)行去甲基化處理，處理后發(fā)現(xiàn)TRIM67在這5條胃癌細(xì)胞株中重新表達(dá)或表達(dá)上調(diào)。
　　3、過表達(dá)或下調(diào)TRIM67對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　TRIM67在胃癌細(xì)胞株和組織的沉默說明該基因有可能是抑癌基因，我們通過TRIM67在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，選取胃癌細(xì)胞株AGS和MKN1。以 RT-PCR和 Wester

11、n blot analysis以驗(yàn)證 TRIM67在 AGS和MKN1的轉(zhuǎn)染效率。過表達(dá)TRIM67后，MTT實(shí)驗(yàn)顯示改基因明顯抑制AGS（P<0.0001）和MKN1（P<0.0001）胃癌細(xì)胞株的細(xì)胞生長(zhǎng)活力；同時(shí)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了TRIM67能夠顯著的抑制AGS（P<0.01）和 MKN1（P<0.01）的細(xì)胞生長(zhǎng)能力及集落形成能力。為進(jìn)一步證明TRIM67對(duì)胃癌的抑制作用，因此我們運(yùn)用RNAi技術(shù)在TRIM67表達(dá)較高的胃

12、癌細(xì)胞株 MKN74中敲除該基因，以穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，MTT實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)證明敲除TRIM67后可促進(jìn)MKN74細(xì)胞的增殖能力（P<0.01）及集落形成能力（P<0.01）。
　　4、胃癌細(xì)胞株中TRIM67對(duì)細(xì)胞周期的作用
　　為確定TRIM67抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的機(jī)制，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析了 TRIM67基因?qū)?xì)胞周期的影響。實(shí)驗(yàn)表明在胃癌細(xì)胞株中過表達(dá)TRIM67能夠明顯增加G1期的細(xì)胞數(shù)，相反在S期的細(xì)

13、胞數(shù)是下降的。同時(shí)對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的研究，我們應(yīng)用 Western blot analysis驗(yàn)證了過表達(dá)TRIM67后對(duì)相關(guān)細(xì)胞周期蛋白的影響，結(jié)果顯示該基因能夠抑制CyclinD1和CDK4的表達(dá)，并且促進(jìn)了P21和P27的表達(dá)，以阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行。
　　5、TRIM67對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響
　　為驗(yàn)證TRIM67與胃癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，我們用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)過表達(dá)TRIM67后的胃癌細(xì)胞株（Annexin V和

14、7-AAD雙染）進(jìn)行凋亡檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AGS和MKN1胃癌細(xì)胞株中，AGS細(xì)胞株中過表達(dá)組的總凋亡數(shù)要大于空白對(duì)照組（P<0.05），在MKN1細(xì)胞株中過表達(dá)組的早期凋亡數(shù)（P<0.001）、晚期凋亡數(shù)（P<0.05）大于對(duì)照組。同時(shí)AGS和MKN1細(xì)胞株轉(zhuǎn)染TRIM67后，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白如活化形式的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和PARP的表達(dá)以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論

15、：
　　1、在胃癌組織中TRIM67mRNA表達(dá)水平要明顯低于癌旁正常組織。
　　2、TRIM67基因的啟動(dòng)子序列高度甲基化是導(dǎo)致該基因在胃癌細(xì)胞株中表達(dá)沉默或下調(diào)的重要因素。
　　3、TRIM67基因可能作為一個(gè)抑癌基因可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和集落形成能力。
　　4研究顯示TRIM67通過抑制cyclin-D1和CDK4并上調(diào)P21和P27影響G1/S期阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行。
　　5、同時(shí) TRIM67基因