敲低TRIM11對結(jié)腸癌細胞HT29增殖及凋亡影響的研究.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建TRIM11基因穩(wěn)定、永久性敲低的人結(jié)腸癌HT29細胞，探討TRIM11基因敲低對HT29細胞生長及5-FU藥物敏感性的影響，為臨床結(jié)腸癌治療尋找新靶點。
　　方法：
　　1.收集經(jīng)組織學(xué)或細胞學(xué)證實的結(jié)腸癌患者術(shù)后新鮮癌組織及癌旁正常組織標本，采用qRT-PCR檢測TRIM11在結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中的表達差異。
　　2.設(shè)計并合成靶向TRIM11基因的sgRN

2、A,連接至LentiCRISPRv2載體，經(jīng)測序驗證后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入病毒包裝細胞293T中，收集病毒上清轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞HT29，應(yīng)用WesternBlot測定轉(zhuǎn)染后HT29細胞中TRIM11蛋白表達量，獲得TRIM11敲低的HT29-KD細胞株。
　　3.用CCK-8法檢測HT29-KD細胞及HT29細胞5天增殖變化，分析TRIM11低表達對HT29細胞增殖的影響。
　　4.應(yīng)用克隆形成實驗比較HT29-KD細胞及HT29細

3、胞克隆形成能力差異，分析TRIM11敲低對腸癌細胞HT29克隆形成能力的影響。
　　5.5-FU誘導(dǎo)HT29-KD細胞及HT29細胞凋亡，24h后行流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，分析TRIM11低表達對化療藥物5-FU誘導(dǎo)HT29細胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1.根據(jù)入排標準，收集到術(shù)后新鮮癌組織及對應(yīng)的癌旁正常組織標本各23例。qRT-PCR結(jié)果顯示：在獲得的23對組織中，有20對組織的腫瘤組織TRIM11表達明顯

4、高于對應(yīng)的癌旁正常組織，經(jīng)配對t檢驗P<0.05(n>3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.成功獲得3種LentiCRISPRv2-sgRNA重組質(zhì)粒，測序結(jié)果顯示sgRNA插入質(zhì)粒DNA的位置、方向及序列與預(yù)期相符；將經(jīng)3種慢病毒（含LentiCRISPRv2-sgRNA重組質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染的HT29細胞行WesternBlot鑒定，發(fā)現(xiàn)3種細胞出現(xiàn)不同程度的TRIM11蛋白表達下調(diào)，其中敲除片段2的細胞幾乎不表達TRIM11蛋白。

5、>　　3.CCK-8增殖檢測結(jié)果顯示：細胞培養(yǎng)至第4、5天時HT29細胞增殖率分別為(891±120)％和（1999±100）%，HT29-KD細胞增殖率分別為（559±58）%和（1200±68）%，經(jīng)配對t檢驗P<0.01(n>3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明敲低TRIM11抑制HT29細胞增殖。
　　4.克隆形成實驗結(jié)果顯示：與HT29細胞克隆形成率為100%的對照組相比，HT29-KD細胞克隆形成率為（25±12.51）%，經(jīng)

6、兩樣本t檢驗P<0.05(n>3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明敲低TRIM11抑制HT29細胞克隆形成。
　　5.流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：5-FU誘導(dǎo)細胞凋亡后，HT29-KD細胞早期凋亡率為（5.43±0.12）%，高于對照組HT29細胞早期凋亡率（4.17±0.31）%，經(jīng)兩樣本t檢驗P﹤0.05(n>3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明敲低TRIM11促進化療藥物5-FU誘導(dǎo)HT29細胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建TRI